【关键词】 吗啡依赖
【Abstract】 AIM: To study whether the blockade of glutamate NMDA receptors in the ventral tegmental area (VTA) modulates the morphine withdrawal in rats. METHODS: The effects of (+) MK801， microinjected unilaterally into the VTA 30 min before naloxone (2 mg/kg， ip) administration， on the morphine withdrawal were assessed. Morphine dependence developed with increasing morphine injection (ip) and morphine withdrawal was induced by injection (ip) of naloxone (2 mg/kg). Wet dog shakes and GellertHoltzman score were used as the indexes to evaluate the intensity of morphine withdrawal. RESULTS: Unilateral microinjection of MK801 into the VTA significantly reduced the GellertHoltzman score and the incidence of wet dog shakes in morphine withdrawal rats. CONCLUSION: MK801 (2， 5， 10 g/L) unilaterally administered into the VTA significantly reduces the intensity of morphine withdrawal syndrome in dependent rats. These data support that glutamatergic transmission in the VTA and its interactions with dopaminergic neurons in the mesolimbic system play some important roles in opiate withdrawal syndrome. Our findings also suggest a potential use of NMDA antagonists in the therapeutic treatment of opiate abuse.
【Keywords】 MK801; Morphine deperdence; substance withdrawal syndrome; receptors， NmethylDaspartate; Rats; ventral tegmental area
【摘要】 目的： 研究中脑―边缘多巴胺回路腹侧被盖区(VTA)内源性谷氨酸信号转导在吗啡戒断形成中的作用. 方法： 给VTA微注射不同剂量谷氨酸NMDA受体拮抗剂（+）MK801，用行为学方法观察对吗啡戒断大鼠戒断症状的影响. 递增量吗啡ip 7 d建立依赖模型，末次给药1.5 h ip盐酸纳洛酮（2 mg/kg）诱发戒断症状，以GellertHoltzman Score和湿狗样颤为评价戒断症状程度的指标，进行统计学分析. 结果： （+）MK801（2， 5， 10 g/L）微注射于VTA可明显减弱吗啡戒断大鼠湿狗样颤的发生次数，且能显著降低吗啡戒断鼠的GellertHoltzman Score. 结论： VTA内源性谷氨酸受体及其与中脑―边缘多巴胺能信号转导相互作用，参与吗啡戒断的形成，提示谷氨酸受体拮抗剂可用于吗啡戒断的治疗.
【关键词】 腹侧被盖区；吗啡依赖；物质禁断综合征受体，N甲基D天冬氨酸；MK801；大鼠
0引言
阿片依赖是一种细胞适应性反应，许多脑区参与，中脑―边缘多巴胺回路系其中之一. 研究表明吗啡戒断大鼠腹侧被盖区（VTA）多巴胺神经元直径、数目减小［1］，放电频率及多巴胺释放量降低［2，3］，可见VTA多巴胺神经元功能下调. VTA多巴胺能神经元既接受自身受体D2的调节，又接受谷氨酸能投射. 激动VTA谷氨酸受体可增加伏隔核多巴胺释放和大鼠运动行为［4］，重复给予吗啡等可增加VTA谷氨酸释放和其受体亚基表达，可见VTA谷氨酸受体功能上调. 但该回路谷氨酸受体在吗啡戒断形成中的作用说法不一，因多数研究以全身或脑室内给药方式进行. 我们在吗啡依赖大鼠诱发戒断前，微注射谷氨酸NMDA受体拮抗剂（+）MK801于VTA，观察其对吗啡戒断症状的影响.
1对象和方法
1.1对象
SD雄性大鼠48只，体质量(235±15) g（西安交通大学医学院实验动物中心）. 盐酸纳洛酮，（+）MK801（美国Sigma公司），盐酸吗啡粉剂（青海制药厂，批号：010202），盐酸吗啡针剂（沈阳制药厂，批号：020907）.
1.2方法
1.2.1手术大鼠在戊巴比妥钠麻醉下，行单侧VTA套管埋植手术，套管埋植在距VTA背侧2 mm处，用不锈钢螺钉和牙科水泥固定在颅骨表面，VTA定位为AP -5.3 mm， ML +0.7 mm， DV -7.7 mm，手术过程用电热毯保持大鼠体温在(37±1) ℃，术后大鼠单笼喂养，且前3 d ip青霉素2000 u/d，术后7 d建立吗啡依赖模型.
1.2.2制模按照文献［5］的方法，首次剂量为10 mg/kg，分别在8：00和16：00各ip 1次，以后吗啡剂量每日增加10 mg/kg，连续注射7 d，其中第6，7日剂量维持在50 mg/kg，建成吗啡依赖模型. 末次给药1 h后，经套管VTA给予(+) MK801 (2， 5，10 g/L)或生理盐水0.5 μL， 30 min后ip盐酸纳洛酮（2 mg/kg）诱发戒断症状［6］，并立即放进透明玻璃缸（50 cm×50 cm×60 cm）内观察大鼠戒断症状1 h.
1.2.3实验分组将大鼠随机分为6组，即第1（盐水对照）组，第2（吗啡依赖对照）组，第3（吗啡戒断对照）组，第4［（+）MK801小剂量治疗］组，第5［（+）MK801中剂量治疗］组和第6［（+）MK801大剂量治疗］组. 每组8只.
1.2.4组织再建行为学观察后，60 mg/kg戊巴比妥钠ip麻醉大鼠，经心灌注200 mL生理盐水快速冲洗血液后，用40 g/L多聚甲醛固定液（0.1 mol/L PB配制，pH 7.4）400 mL灌流1 h，灌注后取脑，置入40 g/L多聚甲醛固定液4℃后固定12 h，再移入250 g/L蔗糖溶液固定24 h以上，按Paxinos大鼠立体定位图谱在前囟后4.8～5.8 mm范围内用冰冻切片机连续冠状切片，片厚50 μm，连续取片，收集于100 mL/L的乙醇溶液，5 g/L Cresyl violet染色［6］，确定给药部位.
1.2.5行为学分析参考FernandezEspejo等［7］的行为学定义和评分标准，戒断症状的严重程度用10个指标衡量，将其分为等级症状（依据出现次数的多少得分）和观察症状（出现即得分）2类，并定义不同的分值，① 等级症状： 湿狗样颤1～2次计2分，3次或更多计4分；后腿直立，跳跃或异常姿势1～4次计1分，5～9次计2分，10次及10次以上计3分；体质量丧失一个百分点计1分. ② 观察症状： 腹泻，眼睑下垂或咬牙出现计2分；激惹或舔阴出现计3分. 累加各戒断症状的得分，求得GellertHoltzman Score 评分.
统计学处理： GellertHoltzman Score评分以x±sx表示，所得数据采用Sigma Stat 2.0统计软件进行统计处理，应用单因素方差分析进行各组间比较，应用Post hoc comparisons (NewmanKeuls) 进行均数间两两比较检验；湿狗样震颤发生次数偏态分布，因此以中位数、25百分位数和75百分位数描述，采用Sigma Stat 2.0统计软件进行统计处理，应用KruskalWallis法进行多样本间的秩和检验，应用MannWhitey U法进行两组间比较，以P&<0.05作为显著性检验的界值.
2结果
2.1组织再建Fig 1表明了各实验组VTA给药的部位. 其中盐水或(+)MK801注射在VTA范围以外的实验动物，在统计分析时已剔除.
2.2(+)MK801治疗对吗啡戒断大鼠GellertHoltzman Score评分的影响各症状的累计GellertHoltzman Score评分应用单因素方差分析（one way ANOVA）显示6组间的评分差异显著，Post hoc comparisons（NewmanKeuls）检验显示第3组的GellertHoltzman Score评分显著高于其他5组（P&<0.01， Fig 2）. （+）MK801微注射于VTA减弱了吗啡戒断大鼠的戒断症状，但3个剂量组间戒断症状评分未见显著性差异.
2.3MK801治疗对吗啡戒断大鼠湿狗样颤的影响湿狗样颤系吗啡戒断大鼠的特征性行为，实验过程中第1，2组均未出现. 第3至6组大鼠均有湿狗样颤发生，KruskalWallis法秩和检验显示各组间湿狗样颤发生次数差异显著，进一步应用MannWhitey U方法进行两样本间比较，第3组显著高于其他5组（P&<0.01），(+)MK801微注射于VTA减弱了吗啡戒断鼠的湿狗样颤症状，但3个剂量组间无显著性差异(Tab 1). 表1吗啡戒断大鼠湿狗样颤发生频数（略）
3讨论
VTA是多巴胺神经元的集中区之一，主要起源于A8A10细胞群，该区的多巴胺神经元同时接受抑制性GABA能和兴奋性谷氨酸能纤维投射，前者的输入减弱或后者的输入增加均会导致VTA多巴胺神经元兴奋. 大量研究证实吗啡依赖和戒断的产生与中枢多巴胺能神经元活动密切相关，伏隔核［8］给予D1受体拮抗剂可诱发吗啡依赖大鼠的戒断症状，而全身给予D1受体激动剂可减弱吗啡戒断症状，可见在吗啡戒断时中枢多巴胺能神经元活动减弱. VTA多巴胺神经元主要投射NAcc和mPFC (medial prefrontal cortex)，同时也投射下丘脑和脑干，而下丘脑和mPFC又是自主神经网络的核心，吗啡戒断引起的VTA多巴胺能神经元活动下调进而引起自主神经系统功能加强，表现出戒断行为，因此有人认为多巴胺间接参与吗啡戒断行为的产生［9］；还有人认为吗啡戒断时运动增强直接由VTA多巴胺D2受体引起［10］. 近期的研究表明吗啡戒断大鼠中脑边缘多巴胺回路谷氨酸能神经元活动加强［11，12］，表现为该回路谷氨酸释放量增加，谷氨酸受体亚基GluR1，NMDAR1 表达上调，全身给予AMPA或NMDA受体拮抗剂可减弱吗啡戒断症状，因此认为在吗啡戒断时中脑―边缘多巴胺回路通过谷氨酸能神经元的活动发挥作用.
吗啡依赖模型建立时给予大剂量盐酸吗啡ip，且用2 mg/kg盐酸纳洛酮诱发戒断行为，以大鼠特异和敏感的行为学指标为参数，换算求得GellertHoltzman Score评分，整体衡量吗啡戒断大鼠戒断症状的程度，同时以大鼠敏感而特异的湿狗样颤发生次数为等级症状的代表，进行统计处理. 在实验过程中，吗啡戒断的特异行为如湿狗样颤、跳跃、扭体，在吗啡依赖对照组和盐水对照组均未出现，可见实验所得数据可靠. 另外GellertHoltzman Score评分系GellertHoltzman 于1978年建立的一种经典的阿片类物质躯体戒断评价指标体系. 实验结果表明VTA单侧微注射（+）MK801能明显减弱了吗啡戒断大鼠的GellertHoltzman Score 评分和湿狗样颤的发生次数，但(+)MK801这一作用在3个不同剂量组间未表现出显著的差异. VTA微注射（+）MK801拮抗了谷氨酸受体，从而降低VTA区多巴胺能活动，可见VTA内源性谷氨酸受体调节吗啡戒断行为的形成. 总之，微注射（+）MK801（2， 5， 10 g/L）于VTA显著减弱吗啡戒断大鼠的GellertHoltzman Score评分和湿狗样颤的发生次数，表明VTA内源性谷氨酸受体，及其与中脑边缘多巴胺能神经元相互作用参与吗啡戒断形成，同时提示谷氨酸受体拮抗剂（+）MK801具有治疗吗啡戒断和复吸作用.
参考文献
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