作者： 王淑华，武胜昔， 周亮，陈亚琼
【关键词】 偏头痛
【Abstract】 AIM: To investigate the effects of estrogen on calcitonin generelated peptide gene expression in the trigeminal ganglion of migraine rats. METHODS: Ovariectomized rats were pided randomly into three groups: ovariectomized group (OVX)， low dose estradioltreated ovariectomized group (OVX+LDET) and high dose estradioltreated ovariectomized group (OVX+HDET). Half of the rats were then used to establish migraine model by subcutaneous injection of nitroglycerin and RTPCR was used to detect the expression level of CGRP mRNA in the trigeminal ganglion of each group. RESULTS: Compared with those in estradioltreated ovariectomized group， the expression of CGRP mRNA in the trigeminal ganglion significantly increased in the ovariectomized group (P&<0.05). In both the ovariectomized group and low dose estradioltreated ovariectomized group， nitroglycerin (NTG) produced a significant increase in the expression of CGRP mRNA than that before the NTG injection (P&<0.05). In high dose estradioltreated ovariectomized group， there was no significant change in CGRP mRNA expression before and after NTG administration (P&>0.05). CONCLUSION: Overexpression of CGRP in the trigeminal ganglion of migraine rat may be one of molecular mechanisms to trigger migraine. Estrogen can modulate the expression of CGRP in the trigeminal ganglion， which may be associated with women migraine.
【Keywords】 estrogen; migraine; calcitonin genepeptide gene; trigeminal ganglion; RTPCR; rat
【摘要】 目的： 研究雌激素对偏头痛大鼠三叉神经节内降钙素相关基因肽(CGRP) mRNA表达的影响. 方法： 成年雌性SD大鼠去卵巢后分为3组： 去卵巢组（OVX）、低雌激素替代组（OVX+LDET）及高雌激素替代组（OVX+HDET）， 随后各组内部分大鼠以皮下注射硝酸甘油（NTG）复制偏头痛模型， 采用RTPCR方法观察三叉神经节内CGRP mRNA表达的变化. 结果： 去卵巢组与雌激素替代组比较， 三叉神经节内CGRP mRNA表达增强（P&<0.05），去卵巢及低雌激素替代组硝酸甘油造模后大鼠三叉神经节内CGRP mRNA与造模前比较表达增强（P&<0.05），而高雌激素替代组造模前后无明显变化（P&>0.05）. 结论： 实验性偏头痛大鼠三叉神经节内CGRP mRNA的过度表达可能是偏头痛发作的分子机制之一， 雌激素通过调控三叉神经节内CGRP mRNA的表达， 可能参与女性偏头痛的发生.
【关键词】 雌激素；偏头痛；降钙素相关基因肽；三叉神经节；RTPCR；大鼠
0引言
大量流行病学资料显示偏头痛的发病有明显的性别差异， 女性的发病率是男性的3~4倍［1］. 绝大多数的女性患者中， 其头痛发作与体内雌激素水平改变有关， 如在月经期、排卵期或产后等. 研究［2］认为女性体内雌激素水平的降低可引起偏头痛的发生，此时若补充雌激素可以控制和预防偏头痛的发生. 但迄今为止， 雌激素在女性偏头痛发病中的作用机制仍不清楚.近年来一些实验研究表明偏头痛发作与三叉神经血管系统的降钙素基因相关肽(CGRP)有密切关系［3］. 三叉神经节作为头面部的初级感觉神经节， 其发出的神经纤维支配颅内脑膜和血管， 而且三叉神经节中含有丰富的CGRP阳性神经元［4］. 我们采用RTPCR观察雌激素对偏头痛大鼠三叉神经节中的CGRP mRNA表达的影响， 以探讨雌激素在女性偏头痛发病中的神经生物学机制， 为临床治疗提供理论依据.
1材料和方法
1.1材料
成年雌性SD大鼠30只，体质量200~250 g，购于第四军医大学实验动物中心; 雌二醇及焦碳酸二乙酯（DEPC， Sigma公司）; 硝酸甘油注射液(广州明兴制药厂); TRIzol试剂、MMLV反转录酶及oligo（DT）1218(Gibco BRL公司); DNaseⅠ(Boehringer Mannheim公司)；RNasin， Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司)； 紫外分光光度计和PTC100 PCR仪分别为日本Hitachi和美国MJ Research公司产品.
1.2方法
1.2.1动物分组及标本制备30只大鼠在戊巴比妥钠（40 mg/kg）ip麻醉下，经脊柱旁切口摘除双侧卵巢，手术后动物恢复1 wk开始实验. 动物随机分3组，每组10只： ① 去卵巢组(OVX)：每日以生理盐水ip 7 d; ② 低雌激素替代组（OVX+LDET）： 每日ip雌二醇0.2 mg/kg， 连续 7 d；③ 高雌激素替代组（OVX+HDET）： 每日ip雌二醇1.0 mg/kg， 连续7 d. 第8日时从3组中各随机抽出5只动物， 根据Tassorelli等［5］报道的方法sc硝酸甘油（NTG， 10 mg/kg），复制实验性偏头痛模型， 剩余各组动物给予花生油（溶剂对照）皮下注射作为对照组. 在NTG造模4 h后， 所有大鼠在戊巴比妥钠（40 mg/kg）ip麻醉下， 以焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的0.01 mol/L PBS经心灌流冲洗血液， 快速取出三叉神经节，立即在干冰上冷冻，-80℃保存.
1.2.2总RNA提取采用异硫氰酸胍法提取总RNA. 首先将组织在0.5 mL TRIzol试剂中用Polytron匀浆器匀浆，室温孵育5 min，加入0.2 mL氯仿，震荡混匀，以9000 g离心10 min.取上层水相，加等体积异丙酮混合，室温孵育10 min. 于4℃以12 000 g离心15 min，弃上清. 沉淀块用70 mL/L乙醇冲洗后，以20 μL DEPC处理的去离子水溶解. 将溶解的总RNA加入含0.01 mmol/L TrisHCl，0.05 mol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2， 2.5 mmol/L DTT和16.67 nkat DNaseⅠ的溶液中，37℃水浴中孵育1 h，然后于95℃处理3 min，用酚/氯仿/异戊醇抽提，以乙酸钠/乙醇沉淀. 将RNA沉淀溶解于DEPC处理的水中，并用紫外分光光度计测量RNA浓度，于-80℃保存备用.
1.2.3反转录合成cDNA在25 μL的反应体系中加入5 μg总RNA、5×反应缓冲液10 μL， 10 mmol/L dNTPs 5 μL， RNase （0.7 pkat/L） 0.5 μL， oligo（DT）12-18 0.25 μg， MMLV反转录酶（3.5 pkat/L）2 μL， 0.01 mmol/L DTT 0.5 μL，置37℃孵育1 h， 然后在65℃加热5 min，储存于-20℃.
1.2.4PCR反应参考大鼠CGRP cDNA序列进行特异性CGRP引物设计. 为检测表达量，选用βactin作为内对照. CGRP引物序列为上游引物： 5′CAA GGA AAA ACG AGG CTG GAC CC3′，下游引物： 5′GGA GGC TGC GGC GGG GAG AT3′，扩增产物的长度为303 bp；βactin引物序列为： 上游引物： 5′TGG TGG TAT GGG TCA GAA GGA CT3′，下游引物： 5′CAT GGC TGG GGT GTT GAA GGT CTC A 3′，扩增产物的长度为265 bp. 两对引物均由上海生工生物技术有限公司合成及纯化. CGRP的PCR扩增体系： 在50 μL的反应体系中加入合成的cDNA 1 μL，10×PCR缓冲液5 μL，dNTPs（2 mmol/L）4 μL，各引物（20 pmol/μL）1 μL ，TaqDNA聚合酶（83.35 mkat/L）0.25 μL，双蒸水补齐反应体积. CGRP的扩增条件为： 93℃ 1 min， 60.1℃ 30 s，72℃ 1 min，反应30个循环，72℃延伸8 min. βactin的扩增条件为： 93℃1 min， 58℃ 30 s， 72℃ 1 min，反应30个循环，72℃延伸8 min. 取各扩增产物10 μL，经25 g/L脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后，用UVP凝胶成像系统进行检测. 用Labworks软件对各阳性条带的灰度进行测定. 以特异性CGRP扩增带灰度值与同管βactin扩增带灰度比值作为CGRP mRNA相对表达量.
统计学处理： 各组实验值以x±s表示，应用SPSS11.0软件进行析因分析，用单因素方差分析分析各因素的单独效应，组间两两比较用Dunnettt检验.
2.1一般状态观察去卵巢组和低雌激素替代组sc硝酸甘油30 min后出现双耳发红、甩头，前肢频繁搔头，活动次数增加. 而高雌激素替代组没有出现上述症状.
2.2琼脂糖凝胶电泳CGRP的PCR扩增产物为303 bp， 作为内对照的βactin扩增产物为265 bp， 各条带位置与按引物序列所推导的PCR产物大小相符，βactin在各组中的表达量基本相同， 表明PCR扩增实验中所加入的模板量是一致的. CGRP mRNA在各组三叉神经节中的表达量存在差异(Fig 1)， 对其表达量进行图像分析和统计分析后发现两因素间存在交互作用（P&<0.05），对其单独效应的分析结果见(Tab 1).表1不同实验组大鼠三叉神经节内CGRPmRNA的相对表达量（略）
3讨论
实验性偏头痛动物模型自1987年Moskwitz报道以来，相继用电生理刺激法、动静脉短路法、硝酸甘油注射法等诱发三类实验性偏头痛动物模型，其中硝酸甘油注射法简便易行，动物易于获得和标准化，是目前国内外承认的实验性偏头痛动物模型之一.
CGRP是1983年Rosenfeld等应用基因重组技术研究发现的一种生物活性多肽，其免疫活性的神经纤维广泛分布于中枢和外周神经及脑血管系统. CGRP具有强烈的扩张血管作用，并能增加毛细血管通透性、血浆蛋白渗出作用，共同参与神经源性炎症的过程. 有研究表明在电刺激三叉神经节的偏头痛大鼠模型中，三叉神经节内CGRP mRNA表达显著增强［6］. 武胜昔等的研究表明伤害性刺激能增加三叉神经节内CGRP的表达［7］，提示CGRP参与头面部的疼痛信息传递过程. CGRP在偏头痛发病中的重要作用已得到临床和实验研究结果的支持［8-10］. 以往的一些研究证实，雌激素可以调控中枢及外周神经系统中CGRP免疫阳性神经纤维的表达，从而影响着CGRP所发挥的病理生理功能. Yang等［11］研究发现雌激素可以使脊髓感觉神经节内CGRP免疫阳性神经元减少，但在中枢神经系统雌激素可以增加CGRP免疫阳性纤维的数量［12］，这可能是雌激素在中枢和外周神经系统对CGRP合成和释放调控的机制不同. 有关雌激素对三叉神经节内CGRP的调控国内外文献报道极少，为避免雌性大鼠自身动情周期雌激素水平波动对CGRP表达的影响，本实验在去卵巢这样一个低雌激素模型的基础上，给予外源性雌激素使体内雌激素水平相对恒定，以观察不同雌激素水平对CGRP影响. 本实验观察到去卵巢雌激素水平降低后三叉神经节内CGRP mRNA的表达与雌激素替代组比较明显增高，这提示了雌激素可以降低三叉神经节内CGRP mRNA的表达. 有实验显示雌激素可以下调三叉神经脊束核尾侧亚核内CGRP的表达，由于三叉神经脊束核尾侧亚核内CGRP阳性纤维主要来源于三叉神经节［13］，上述结果支持本实验的观察. 当给予硝酸甘油造模后，我们观察到去卵巢组和去卵巢低雌激素组三叉神经节内CGRP mRNA的表达与造模前相比增强，动物出现行为学变化，提示偏头痛发作时三叉神经节细胞处于激活状态，细胞内CGRP mRNA的表达增强. 在高雌激素替代组，造模前后CGRP mRNA未发现显著差异，动物也没有出现行为学改变，提示高剂量雌激素可能抑制了硝酸甘油诱发的三叉神经节细胞的激活，降低了三叉神经节内CGRP基因的表达水平，可能在偏头痛的预防中发挥一定的作用. 这可以解释临床上雌激素可以改善偏头痛症状，以及大多数妇女在雌激素水平较高的妊娠期，偏头痛症状缓解的原因. 由此我们推测在月经期、排卵期和产后，雌激素水平降低时诱发的偏头痛与三叉神经血管通路中关键递质CGRP的改变有关. 但雌激素对CGRP的调节机制还有待于进一步研究.
参考文献
［1］ TfeltHansen P. History of headache research in Denmark ［J］. Cephalalgia， 2001;21 (7): 748-752.
［2］ Labbe EE， Murphy L. Psychosocial factors and the prediction of headaches in college students ［J］. Headache， 1997; 37: 1-5.
［3］ Buzzi MG， Moskowitz MA. The trigeminovascular system migraine ［J］. Pathol Bilo （Paris）， 1992; 40: 313-316.
［4］ Rosenfeld MG， Mermod JJ， Amara SG， et al. Production of a novel neuropeptide encoded by the calcitonin gene via tissuespecific RNA processing ［J］ . Nature， 1983; 303: 129-135.
［5］ Tassorelli C， Nappi G， Foseph SA. Systemic nitroglycerin induces Fos immunoreactivity in rat brain ［J］. Exp Headache Models， 1995; 3(4): 229-234.
［6］ 钟广伟，李炜，邓干初，等. 针刺对偏头痛大鼠脑内降钙素相关基因肽基因表达的影响［J］. 中国临床康复，2002; 24（6）：3680-3681.
Zhong GW， Li W， Deng GC， et al. Effect of acupuncture on calcitonin generelated peptide gene expressions in the brain of migraine rats ［J］. Chin J Clin Rehabil， 2002; 24(6): 3680-3681.
［7］武胜昔，王亚云，李云庆，等. 大鼠三叉神经节及尾侧亚核内降钙素相关基因肽在面口部伤害性刺激时的动态变化［J］. 解剖学报，1998; 29(2): 145-150.
Wu SX， Wang YY， Li YQ， et al. Changes of calcitonin generelated peptide mRNA expressions and immunoreactivity in the caudal spinal trigeminal nucleus and trigeminal ganglion after noxious stimulation ［J］. Acta Anat Sinica， 1998; 29(2):145-150.
［8］ Durham PL， Russso AF. New insights into the molecular actions of serotonergic antimigraine drugs ［J］. Pharmacol Therapeutics， 2002; 94(12): 77-92.
［9］ Fanciullacci M， Alessandri M， FIGINI M， et al. Increase in plasma calcitonin generelated peptide from the extracerebral circulation during nitroglycerininduced cluster headache attack ［J］. Pain， 1995; 60(2): 119-123.
［10］ Oldman AD， Smith LA， McQuay， et al. Pharmacological treatments for acute migraine: Quantitative systematic review ［J］. Pain， 2002; 97(3): 247-257.
［11］ Yang Y， Ozawa H， Yuri K， et al. Immunocytochemical analysis of sex differences in calcitonin generelated peptide in the rat dorsal root ganglion with special reference to estrogen and its receptor ［J］. Brain Res， 1998; 791: 35-42.
［12］ Yuri K， Kawata M. Semiquantitative analysis of the effects of estrogen on CGRP and methionineenkephalinimmunoreactivity in the periventricular preoptic nucleus and the medial preoptic area of female rats ［J］. Brain Res， 1992;578:282-288.
［13］ Pardutaz A， Multon S， Malgrange B， et al. Effect of systemic nitroglycerin on CGRP and 5HT afferents to rat caudal spinal trigeminal nucleus and its modulation by estrogen ［J］. Eur J Neurosci， 2002; 15: 1803-1809.