作者：宋立强，戚好文，李妍，王吉村，林爱华
【关键词】 杯状细胞
【Abstract】 AIM: To investigate the effects of human calciumactivated chloride channel 1 (hCLCA1) on synthesis of mucin in airway goblet cells. METHODS: Recombined eukaryotic expression plasmid pIRES2EFGP/hCLCA1， which contained fluorescence tag and G418 screening flag was constructed. The plasmid was stably transfected into NCIh392 cell line， which was regarded as goblet cell model in vitro. Transfected NCIh392/hCLCA1 cells were identified by fluorescence microscopy and hCLCA1 mRNA was detected by RTPCR. Cells were pided into four groups with or without hCLCA1 inhibitor NFA: ① NCIh392; ② NCIh392/hCLCA1; ③ NCIh392+NFA; ④ NCIh392/hCLCA1+NFA. The proliferation of the cells in all groups was detected using MTT colorimetry. The expression of mucin MUC5AC protein and mRNA was examined with PAS staining and RTPCR assay， respectively. RESULTS: NCIh392/hCLCA1 cells that stably expressed hCLCA1 were obtained. The proliferation capability， mucin protein expression and mRNA level of NCIh392/hCLCA1 cells were all significantly higher than those of untransfected cells. NFA markedly inhibited the above changes of NCIh392/hCLCA1 cells. CONCLUSION: hCLCA1 promotes the proliferation and mucin synthesis in airway goblet cells. This study indicates that the inhibition of hCLCA1 may be a potential treatment for asthma.
【Keywords】 asthma; airway; epithelial cells; goblet cells; chloride channel
【摘要】 目的： 探讨人激活Cl通道I型（hCLCA1）在气道杯状细胞合成黏蛋白中的调控作用. 方法： 以人气道黏液上皮细胞系NCIh392作为杯状细胞特性研究的体外模型，构建携带荧光蛋白标签的真核表达质粒pIRES2EFGP/hCLCA1，转染NCIh392细胞，用G418筛选稳定表达hCLCA1的细胞NCIh392/hCLCA1. 对被转染细胞采用荧光显微镜和RTPCR法检测hCLCA1 mRNA. 根据NFA（hCLCA1阻断剂）干预与否，将细胞分为4组： ① NCIh392；② NCIh392/hCLCA1；③ NCIh392+NFA；④ NCIh392/hCLCA1+NFA. MTT法检测各组细胞的增殖活性；PAS特染法检测各组细胞黏液糖蛋白的表达状况， RTPCR法检测黏蛋白MUC5AC mRNA水平. 结果： 经过500g/L的G418筛选，证实获得NCIh392/hCLCA1细胞. 对各组细胞检测结果表明，NCIh392/hCLCA1细胞的增殖活性、黏液糖蛋白表达量及MUC5AC mRNA水平均显著高于亲本细胞，并且NFA能有效抑制NCIh392/hCLCA1的这些生物活性改变. 结论： hCLCA1能有效促进气道杯状细胞的增殖能力及黏蛋白合成，早期阻断hCLCA1可能是哮喘防治的有效途径之一.
【关键词】 哮喘；气道；上皮细胞；杯状细胞；氯化物通道
0引言
气道上皮杯状细胞增生及伴随的黏蛋白高分泌是哮喘的主要病理特点之一，并已成为病情加重的指征［1］. 杯状细胞产生的黏蛋白MUC5AC被认为是该细胞增生的标志［2］. NCIh392是一种人气道黏液上皮细胞系，能产生多种黏蛋白，常被作为杯状细胞功能特点研究的体外模型［3］. Hoshino等［4］和Toda等［5］相继证实，哮喘患者气道杯状细胞的人钙激活Cl通道I型（human calciumactivated chloride channel， hCLCA1）高表达. hCLCA1属于一种新近发现的跨膜阴离子通道家族，一般认为该家族与胞膜转运水和电解质的功能相关. 我们拟利用体外培养NCIh392细胞，探讨hCLCA1与黏蛋白合成的关系.
1材料和方法
1.1材料
人气道黏液上皮细胞系NCIh392(西京医院呼吸内科实验室保存)；pcDNA3.1(+)/hCLCA1质粒(美国Levitt RC教授惠赠)；CLCA阻断剂NFA（niflumic acid）(Sigma公司)；大肠杆菌JM109及真核表达载体pIRES2EGFP（具有双顺反子）（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室）；γTaq DNA多聚酶、T4 DNA连接酶及限制性内切酶NheⅠ， XholⅠ （TaKaRa公司）；RevertAidTM逆转录试剂盒（Fermentas公司）.
1.2方法
1.2.1pIRES2EGFP/hCLCA1表达质粒的构建采用NheⅠ和XholⅠ从质粒pcDNA3.1(+)/hCLCA1中切出hCLCA1基因片段，将其亚克隆入相同酶切的载体pIRES2EGFP，重组质粒命名为pIRES2EGFP/hCLCA1. 转染大肠杆菌JM109感受态细胞，铺板（含卡那霉素），挑克隆，酶切电泳鉴定. 测序鉴定由上海鼎安科技公司完成.
1.2.2细胞转染及筛选① 新霉素（G418）浓度的确定以细胞密度4×105 /孔将NCIh392细胞接种于24孔板中，采用含100 mL/L灭活小牛血清的DMEM进行培养，并分别加入梯度浓度G418（200， 300， 400， 500， 600， 700， 800 g/L）. 培养10~14 d，选择能全部杀死细胞所用G418的最低浓度. ② 转染与筛选参照Lipofect AMINE 2000TM试剂说明书，在Lipofectin介导下将pIRES2EFGP/hCLCA1转染NCIh392细胞. 72 h后，改用含G418培养液筛选3~4 wk. 获得的细胞命名为NCIh392/hCLCA1.
1.2.3转染细胞鉴定① 荧光显微镜下观察细胞荧光蛋白表达情况. ②分别收集转染细胞NCIh392/hCLCA1和亲本细胞NCIh392，经TRI REAGENT抽提细胞总RNA，按照RevertAidTM逆转录试剂盒产品说明操作步骤，合成cDNA第1链，紫外吸收法定量后，用PCR法扩增目的片段. 参照文献［3］合成hCLCA1及内参照GAPDH的上下游引物. hCLCA1 5′端引物： TGA TGC TAC TAA GGA TGA C，3′端引物： TTC CTC AGA GTT GGC TTC CT. GAPDH 5′端引物： ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC，3′端引物： TCC ACC ACC ACC CTG TTG CTG TA. hCLCA1循环参数： 94℃变性30 s， 63℃退火1 min，72℃延伸1 min； GAPDH循环参数： 94℃变性20 s， 59℃退火20 s， 72℃延伸20 s；均循环35次. 各PCR扩增产物行琼脂糖凝胶电泳鉴定.
1.2.4细胞分组根据NFA干预与否分成4组： ① NCIh392；② NCIh392+NFA，待细胞长至对数生长期，加入终浓度为100 mg/L的NFA干预24 h; ③ NCIh392/hCLCA1；④ NCIh392/hCLCA1+NFA，干预方案同②. 各组实验重复5次.
1.2.5MTT法检测细胞的增殖活性将各组细胞以5×104/孔种植于96孔培养板，待NFA干预24 h后，每孔加入MTT溶液200 μL，继续培养4 h. 去上清，每孔加入DMSO 200 μL. 轻度振荡混匀后，用酶联免疫吸附测定仪测定A490 nm.
1.2.6PAS特染法检测细胞黏液糖蛋白的表达取各组细胞爬片，高碘酸氧化液中浸泡10~20 min. 蒸馏水洗2次. Schiff液染色10 min. 流水清洗5 min. 用Harris明矾苏木精衬染核2~3 min. 5 mL/L盐酸乙醇分化30 s，自来水冲洗5 min返蓝. 系列乙醇脱水，二甲苯透明，封片.
1.2.7RTPCR法检测黏蛋白MUC5AC mRNA同1.2.3中RTPCR步骤，合成各组细胞cDNA第1链后，进行目的片段的扩增. 参照文献［6］合成MUC5AC的上下游引物，MUC5AC 5′端引物： TCC GGC CTC ATC TTC TCC，3′端引物： ACT TGG GCA CTG GTG CTG. 94℃变性30 s，60℃退火50 s， 72℃延伸50 s，循环35次. GAPDH为内参照. 利用ImageTool 3.0图像分析软件，测量各组MUC5AC条带与GAPDH条带的灰度值.
统计学处理： 实验数据以x±s表示，通过SPSS 10.0软件进行统计分析. 多组间比较采用析因设计资料的方差分析.
2结果
2.1重组质粒pIRES2EGFP/hCLCA1的鉴定将质粒pIRES2EGFP/hCLCA1用NheⅠ和XholⅠ双酶切后电泳，得到5300 bp和2900 bp 2个片段，分别与载体及目的基因的预期大小一致. 初步说明重组表达质粒的构建正确（Fig 1）. 测序结果显示，目的基因片段的序列与GenBank中No.AF039400的登录序列完全相同.
2.2细胞转染效果梯度浓度G418的干预结果表明，500 g/L为最适筛选浓度，连续筛选3 wk. 倒置显微镜下观察，所有存活细胞呈现单层贴壁生长的梭性或多边形，与亲本NCIh392细胞形态相似. 荧光显微镜下观察可见，NCIh392/hCLCA1细胞的整个胞体显现出淡绿色荧光，尤以胞核明显. RTPCR法检测hCLCA1 mRNA水平，电泳结果可见NCIh392/hCLCA1细胞组在预期523 bp处出现清晰条带，而亲本细胞组为阴性. 其中GAPDH cDNA大小为411 bp （Fig 2）. 标签蛋白翻译水平和目的蛋白转录水平的检测均表明，重组质粒pIRES2EGFP/hCLCA1转染及表达过程成功.
2.3细胞增殖活性与NCIh392细胞组相比，NCIh392/hCLCA1细胞组的A490 nm值显著升高（P&<0.01），NCIh392细胞+NFA组A490 nm值有降低的趋势，但尚无显著差别. NCIh392/hCLCA1细胞+NFA组的A490 nm值，明显低于NCIh392/hCLCA1细胞组（P&<0.01），但仍然高于NCIh392细胞组（P&<0.01， Fig 3）.
2.4细胞黏液糖蛋白的表达NCIh392/hCLCA1细胞的胞质普遍出现深紫红色颗粒；而其他3组的细胞胞质均呈很淡的紫红色，且着色程度相近（Fig 4）.
2.5黏蛋白MUC5AC mRNA水平由Fig 5电泳结果可见，各组均在预期679 bp处出现特异性条带. NCIh392/hCLCA1细胞组的灰度值（235±3）明显高于NCIh392细胞组（173±3）和NCIh392/hCLCA1细胞+NFA组（180±5）（均P&<0.01），而后两组的灰度值之间仍有差异. NCIh392细胞组与NCIh392细胞+NFA组的灰度值（169±4）无显著差别. 各组内参照之间无差异.
黏液糖蛋白主要由杯状细胞产生，是气道粘液层的主要成份，并能使黏液具备弹性和粘附性的生理特性. 然而，杯状细胞异常增生或化生及由此产生的气道黏液高分泌，是哮喘的重要病理特征. 临床研究证实，黏液高分泌病史是肺功能第1秒用力呼气量（FEV1）下降加速的独立危险因素. 在哮喘病情加重过程中，这种过度分泌而导致的气道阻塞尤为突出，常成为重症哮喘的主要死因之一. 由于杯状细胞产生黏蛋白的机制尚未完全弄清，目前临床没有针对性药物. 近年来，IL9， IL4， IL13等Th3细胞因子等外界因素以及杯状细胞自身表皮生长因子受体（EGFR）、凋亡抑制蛋白Bcl2等对粘蛋白产生的促进作用，先后得到证实［7］. 尤其引人注目的是杯状细胞CLCA与黏蛋白分泌的关系. 2001年Nakanishi等［3］首先利用正义和反义RNA技术证明，小鼠气道杯状细胞钙激活Cl通道Ⅲ型（mCLCA3）高表达，是致敏哮喘小鼠粘液高分泌的关键环节. 而正常小鼠mCLCA3表达量极低. 次年Hoshino等［4］报道mCLCA3的异种同源蛋白hCLCA1在哮喘患者杯状细胞高表达，是正常人群的近3倍. Toda等［5］的结果还表明，杯状细胞hCLCA1 mRNA与IL9R两者的阳性率密切相关，提示hCLCA1与其他促分泌因素有着内在联系. 因此，进一步通过离体实验证实hCLCA1与杯状细胞黏蛋白产生的因果关系，将为通过阻断CLCA来控制气道黏液高分泌提供理论依据. 我们首先证实在NCIh392细胞未能检测到hCLCA1 mRNA. 利用基因工程技术，成功地将带有hCLCA1基因的真核表达载体导入NCIh392细胞. 从标签蛋白的表达、hCLCA1的转录两方面证实筛选出NCIh392/hCLCA1稳定转染的细胞. 在此基础上，MTT法结果显示NCIh392/hCLCA1细胞的增殖活性高于亲本细胞.
PAS特染及RTPCR法检测表明，NCIh392/hCLCA1细胞中黏蛋白MUC5AC的含量显著高于亲本细胞. 这与在体研究结果相一致［3］. 而CLCA通道阻断剂NFA有效减低了NCIh392/hCLCA1细胞的高增殖活性、黏蛋白高表达. 正反两方面均证实hCLCA1对粘蛋白合成具有促进作用. 这可能与CLCA对胞内高Ca2＋的维持有着正反馈效应有关［8］. 还需深入研究的是CLCA的胞内信号转导机制及与其他促进因素的关系.
参考文献
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［2］ Zuhdi AM， Piazza FM， Selby DM， et al. Muc5/5ac mucin messenger RNA and protein expression is a marker of goblet cell metaplasia in murine airways ［J］. Am J Respir Cell Mol Biol， 2000; 22: 253-260.
［3］ Nakanishi A， Morita S， Iwashita H， et al. Role of gob5 in mucus overproduction and airway hyperresponsiveness in asthma ［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2001; 98(9): 5175-5180.
［4］ Hoshino M， Morita S， Iwashita H， et al. Increased expression of the Human Ca2+activated Cl Channel 1 (CaCC1) gene in the asthmatic airway ［J］. Am J Respir Crit Care Med， 2002; 165(8): 1132-1136.
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