作者：张思河 舒青 马群风 张青 秦鸿雁 李军林
【关键词】 YNZ22位点
关键词: YNZ22位点;食管肿瘤/遗传学;串联重复序列
摘 要:目的 研究YNZ22位点多态性在陕西汉族人群中分布规律及其与食管癌遗传易感性的关系. 方法 应用PCR-Amp-FLP技术，对陕西正常人群（71例）、食管癌组织（38例）及癌旁组织（31例）YNZ22-VNTR位点进行多态性分析. 结果 在正常人群中YNZ22位点共检出29种基因型，10个等位基因片段，片段大小范围在168～938bp之间，杂合度为70.42%，PIC为0.84;在食管癌中共检出YNZ22位点11种基因型，8个等位基因片段，杂合度为10.15%，PIC为0.76;在癌旁组织中共检出YNZ22位点15种基因型，9个等位基因片段，杂合度为46.67%，PIC为0.79;正常人群与食管癌群体等位基因频率分布差异显著（χ2 =41.28;P&<0.01，DF=7）.在配对的食管癌及癌旁组织中，15例（50%）癌组织在该位点发生突变，其中8例发生杂合性丢失，7例发生纯合型核心片段重复数减少.在正常人群中A7，A8两等位基因片段均可检到，在癌旁组织中只检到A8基因片段，而在食管癌组织中二者均末检到. 结论 YNZ22为高度多态的遗传标记.其多态性改变（核心片段重复数减少）与食管癌的易感性关系较密切.
Keywords:YNZ22locus;esophageal neoplasms/genetics;tandem repeat sequences
Abstract:AIM To observe the polymorphism of YNZ22lo-cus in71normal unrelated subjects from Han population in Shaanxi Province，and assess its possible relationship with susceptibility of esophageal cancer so as to provide clues for genetic markers of esophageal cancer.METHODS The polymorphism of YNZ22-VNTR locus was studied by PCR-Amp-FLP in the71normal subjects，38esophageal cancer samples and31pericancerous non-tumor samples.RESULTS Twenty-nine genotypes and10alleles ranging from168bp to938bp were detected in the71normal subjects.The het-erozygosity and PIC of YNZ22were70.42%and0.84re-spectively;11genotypes and8alleles were detected in esophageal cancer tissues.The heterozygosity was10.15%and PIC was0.76;15genotypes and9alleles were detected in pericancerous non-tumor tissues.The heterozygosity was46.67%and PIC was0.79.There was a significant differ-ence in allele frequency between that of the normal subjects and that of esophageal cancer（χ2 =41.28;P&<0.01，DF=7）.Among the partnerships between esophageal cancer tis-sues and pericancerous non-tumor tissues，mutation of YNZ22locus was observed in15cases（Loss of heterozygosi-ty was detected in8cases and pure reduction in core segment repetition number was detected in7cases）.A7and A8allele fragments were all detected in the71normal subjects，and only A8allele fragment was detected in pericancerous non-tu-mor tissues.Neither of the two allele fragments was detected in esophageal cancer tissues.CONCLUSION YNZ22is a highly polymorphic genetic marker.There should be a closer correlation between the alteration of its polymorphism（re-duction of core segment repetition number）and esophageal cancer susceptibility.
0 引言
食管癌是陕西常见的恶性肿瘤，具有高发和家族聚集现象.YNZ22（17p13.3）是17p末端杂合度较高的多态遗传标记位点，并与Miller-Dieker综合征密切相关.由于其位于抑癌基因p53（17p13.1）近侧，并与之连锁，故常用于肿瘤杂合性丢失（loss of het-erozygosity，LOH）的研究，间接提示抑癌基因p53的突变情况.迄今国内外尚末见到关于YNZ22位点多态性分布与食管癌遗传易感性关系的报道，我们应用PCR-Amp-FLP技术比较了陕西汉族正常人群与食管癌人群YNZ22位点等位基因多态性分布，试图阐明YNZ22能否成为食管癌人群群体中理想的遗传易感性标记.
1 材料和方法
1.1 材料 71例正常无血缘关系的陕西汉族人群血液样本;38例鳞状食管癌标本;31例癌旁组织标本（均由唐都医院胸外科提供，癌及癌旁组织经病理组织切片确诊）.
1.2 方法
1.2.1 DNA提取 抗凝血（3～5mL）或组织块采用常规蛋白酶K，酚氯仿法进行抽提.
1.2.2 PCR反应 总反应体积30μL，内含dNTPs200μmol・L-1 ，一对引物各25pmol・L-1 ，Taq DNA聚合酶（华美公司）2.5IU，模板DNA约5ng.PCR引物:5’-CGAAGAGTGAAGTGCACAGG-3’和5’-CACAGTCTTTATTCTTCAGCG-3’（赛百盛公司）.PCR程序:94℃变性45s;55℃复性45s;72℃延伸60s，循环30次，最后一次循环72℃延伸10min.
1.2.3 扩增产物检测 20g・L-1 琼脂糖凝胶，含溴乙锭1mg・L-1 ，于扩增产物中加入1/5体积的上样缓冲液进行电泳，以100bp DNA Ladder（华美公司）为标准判型.电压4～5V・cm-1 ，电泳2h，EB染色.在紫外检测仪下观察并照相.
统计学处理:基因型及等位基因频率用直接计数法，并按Hardy-Weinberg平衡原理确认样本之群体代表性;组间基因型及等位基因频率差异用χ2 检验;观察杂合度（heterozygosity observed，HO）和多态信息量（polymorphism information content，PIC）按Cooper等［1］ 的公式计算;期望杂合度（heterozy-gosity expected，HE）按Nei等［2］ 的公式计算.
2 结果
2.1 陕西正常汉族人群YNZ22位点等位基因的多态性 71例陕西正常汉族人群中共检出YNZ22位点10个等位基因（Fig1）.片段大小范围在168～938bp之间，依据重复单位重复次数不同将等位基因依次命名为A1，A2……An（A为allele缩写）.基 因频率分布在0.0141～0.2817之间，最常见的等位基因是A4，少见的是A11（Tab1）.检出的29种基因型中，最常见的基因型是A4/A4，其次是A4/A5，A4/A12……A12/A12（Tab2）.
图1略
表1 陕西正常汉族人群、食管癌人群癌组织及癌旁组织YNZ22位点等位基因分布 略
2.2 陕西汉族食管癌人群YNZ22位点等位基因的多态性 38例陕西汉族食管癌人群中共检出YNZ22位点8个等位基因.片段大小范围在168～938bp之间，基因频率分布在0.0132～0.3421之间，最常见的等位基因是A4，少见的是A6（Tab1）.检出的11种基因型中，最常见的基因型是A4/A4，其次是A1/A1，A3/A3……A5/A11（Tab2）.
2.3 陕西汉族食管癌人群癌旁组织YNZ22位点等位基因的多态性 31例陕西汉族食管癌对应的癌旁组织中共检出YNZ22位点9个等位基因.片段大小在168～938bp之间，基因频率分布在0.0161～0.3226之间，最常见的等位基因是A4，少见的是A6和A11（Tab1）.检出的15种基因型中，最常见的基因型是A4/A4，其次是A1/A1，A1/A4……A12/A112（Tab2）.
表2 陕西正常汉族人群、食管癌人群及癌旁组织YNZ22位点基因型分布 略
2.4 陕西正常汉族人群、食管癌人群癌组织、癌旁组织YNZ22位点等位基因多态性分布比较对检出的对应等位基因频率分布统计分析表明:正常人群与食 管癌人群癌组织之间差异显著（χ2 =41.278;χ20.05 =14.067，χ20.01 =18.475，DF=7）.正常人群与食管癌人群癌旁组织间、食管癌人群癌组织与癌旁组织间均无显著差异（前者χ2 =13.89;χ20.05 =15.51，χ20.01 =20.09，DF=8;后者χ2 =7.42;χ20.05 =14.07，χ20.01 =118.48，DF=7）.食管癌中也存在YNZ22位点的LOH现象（8/30），与其他肿瘤中此位点的LOH发生率相比偏低（Fig2）.
3 讨论
YNZ22又名D17S5，D17S22，D17S30，D17-S1167，UT83，位于17p13.3，是17p末端杂合度较高的多态标记位点.Wolf等［3］ 发现该位点是由70bp重复单位多拷贝组成，其核心顺序为TGGAGT-CTCTGGGTGTCGTGCGTCAGAGT，呈现高度的可变数目串联重复（variable number of tandem re-peat，VNTR）多态性.VNTR是人类基因组中理想的遗传标记，目前在脆性X综合征和Huntington舞蹈症等疾病中均发现其疾病的产生与短片段大量重复密切相关，故称之为动态突变.Singh等［4］ 在原发性乳腺癌中发现，64.0%（28/44）存在p53基因的LOH，而43.0%（26/61）存在YNZ22的LOH.Dockhorn-Dworniczak等［5］ 检测胃癌、骨肉瘤和Ewing’s瘤时发现，71.0%（49/69）YNZ22位点存在LOH，等位基因缺失在胃癌中为12.8%（5/39），Ewing’s瘤中为11.1%（1/9），骨肉瘤中为20.0%（4/20）.胡应等［6］ 发现，原发性肝癌（PHC）中YNZ22存在LOH（16/34）.
Deka等［7］ 在印度的Kachari人、加拿大Dogrib地区印第安人、巴布亚新几内亚新高地人，德国北部的高加索人中，共检出YNZ22位点15种不同等位基因，杂合度从54.0%到89.0%.Gene等［8］ 在西班牙加泰罗尼亚人中检出14个等位基因，56种基因型，杂合度为81.4%;胡应等［6］ 、陈林等［9］ 在上海和成都汉族人群中分别检出12和10个等位基因，杂合度分别为84.4%和78.0%;Harashima等［10］ 在日本人中检出10个等位基因，39种基因型，杂合度为83.5%;Laszik等［11］ 在来自布达佩斯的高加索人中检出13个等位基因，51种基因型，杂合度为80.0%;我们在陕西汉族人群共检出10个等位基因（168～798bp），29种基因型，杂合度为70.4%，PIC为0.8440.这表明YNZ22在陕西正常人群中为高度多态性位点，可提供的信息量大.
我们已发现Rb基因17，20内含子VNTR多态性的改变与食管癌遗传易感性关系较密切［12，13］ .本研究又比较了正常人群、食管癌人群癌组织与癌旁组织中与p53基因连锁的YNZ22位点等位基因的数目、杂合度、PIC，发现都表现为正常人群&>癌旁组织&>癌组织.这说明，此等位基因片段的丢失可能与食管癌发生有关，因片段丢失而导致了其杂合度和PIC的降低.我们注意到，在正常人群中A7、A8两等位基因均可检到，在癌旁组织中只检到A8基因，而在食管癌中二者则均末检出.这提示A7、A8二等位基因的丢失可能与陕西食管癌的易患关系密切.在三组人群中均末检测到A9、A10两等位基因.可能是受所收集标本数量限制的原因;另外，从配对的食管癌及癌旁组织检测结果来看，15对发生了YNZ22位点突变（占50.0%），其中8例为LOH，以A1A4→A1A1为主（占3/8）且多发生于Ⅰ或Ⅱ期，另外片段大小改变的7例中，核心片段重复数减少占6例且多发生于Ⅱ期或Ⅰ～Ⅱ期，核心片段重复数增多仅占1例.这说明核心片段重复数减少很可能在食管癌变中起重要作用.结果推测:陕西食管癌高发可能与该位点核心片段重复数减少有关.
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