关于哮喘小鼠肺内CGRP免疫反应阳性神经纤维的变化

　　　　　　 作者：楚东岭　宋俊峰　饶志仁　邱建勇　冯蕾

【关键词】 哮喘
　　关键词: 哮喘;降钙素基因相关肽;神经纤维;免疫组织化学;小鼠
　　
　　摘 要:目的 探讨BALB/c小鼠哮喘后肺内CGRP免疫阳性神经纤维分布及形态变化. 方法 成年雄性小鼠随机分为正常组和哮喘组，采用免疫组织化学法观察小鼠肺内CGRP免疫反应神经纤维的变化. 结果 哮喘组肺内CGRP免疫反应神经纤维数量及分布发生了显著变化，从肺内支气管到终末细支气管均有较密集的CGRP免疫反应阳性纤维分布，成束走行，以平滑肌外层和粘膜下层为主.此外，粘膜表面可见裸露的阳性纤维.哮喘组与正常对照组比较CGRP免疫反应阳性纤维的数量显著增加（P&<0.01）. 结论 肺内CGRP免疫反应神经纤维增生与哮喘发病密切相关，并可能是导致哮喘持续和发展的原因之一.
　　
　　Keywords:asthma;calcitonin gene-related peptide;nerve fibers;immunohistochemistry;mouse
　　
　　Abstract:AIM To investigate the changes of distribution of the calcitonin gene related peptide（CGRP）in the lungs of asthmatic mice.METHODS The mice were pided into asthma group and control group.Immunohistochemistry and computer image analysis were used in this study.
　　RESULTS　There were significant changes in distribution and numbers of CGRP-IR positive fibers in airways of asthma group.The positive fibers were detected on the walls of respiratory bron-chioles and alveolar ducts，emerging like a string of beads，and appearing as large fiber bundles，especially on the smooth muscle layer and basement membrane.In addition，nude CGRP-IR positive fibers were shown on the mucosa.The numbers of positive fiber were clearly increased in asth-ma group（P&<0.01）.CONCLUSION There is close rela-tionship between the growth of CGRP-positive nerve fibers and attack of asthma，which may be a reason for persistence and progress of asthma.
　　
　　0 引言
　　
　　近年来随着有关神经肽研究的不断深入，证实呼吸道广泛存在着神经肽网，神经肽与哮喘的发病关系日益受到国内外学者的关注.有研究表明，哮喘时患者肺泡灌洗液及血液CGRP含量明显高于对照组［1］ ，提示CGRP可能参与了哮喘的发病过程.然而对哮喘时CGRP增多的确切原因尚不清楚.已知CGRP在肺内尤其在粘膜及粘膜下主要分布于迷走神经传人纤维内，通过轴索反射释放或迷走反射能导致血管扩张、通透性增加、炎性细胞尤其是嗜酸性细胞在气道周围浸润.含CGRP纤维在肺内分布多寡或（和）其活性增高可能是造成气道高反应性的原因之一.我们应用免疫组织化学方法结合图像分析技术研究了哮喘时肺内CGRP免疫反应（CGRP-IR）阳性纤维的分布和形态改变，为探明哮喘的机制提供实验依据.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 成年雄性BALB/c小鼠20只，体质量18～20g，本校实验动物中心提供.随机分为2组，即哮喘组和对照组.
　　
　　1.2 方法 ①哮喘组按文献［2］复制小鼠哮喘动物模型，即实验的第0日腹腔内注射100g・L-1 卵白蛋白0.2mL;第15日开始吸入10g・L-1 卵白蛋白气溶胶30min，每日1次，连续14d.对照组用生理盐水代替卵白蛋白.②于实验第30日以戊巴比妥钠（40mg・kg-1 ，ip）麻醉豚鼠，开胸经主动脉灌注10mL生理盐水，继以新配制的4℃40g・L-1 多聚甲醛PB溶液（0.1mol・L-1 ，pH7.4）50mL持续灌注10min，取出肺脏，4℃40g・L-1 多聚甲醛后固定24h，入200g・L-1 蔗糖PB溶液中，4℃过夜.③HE染色:恒冷箱切片，片厚8μm，贴片于10g・L-1 明胶+50mg・L-1 硫酸铬钾处理过的载玻片上，室温干燥30min后，常规HE染色.④免疫组织化学染色，片厚14μm，贴于载玻片上，室温干燥30min后，以0.01mol・L-1 KPBS（pH7.4）浸洗，经800mL・L-1 甲醇+30mL・L-1 h3 O
2 封闭15min，入30mL・L-1 Triton X-100中30min，KPBS浸洗3×10min，切片入兔抗CGRP血清（1∶4000，Onco-gene Science）室温孵育24h.KPBS浸洗3×10min，入结合生物素的羊抗兔IgG血清（1∶500，Sigma），室温孵育3h，KPBS浸洗3×10min，入ABC复合物（1∶500，Sigma）室温孵育2h.葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺法显色.显色反应终止后，常规脱水透明，DPX封片.⑤图像分析:以肺内气道为分析对象，显微镜下图像分析，测量单位玻片面积内CGRP-IR阳性纤维条数.
　　
　　统计学处理:按均数和标准差进行两组t检验.
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 正常及哮喘小鼠肺组织HE染色 与正常组相比哮喘组可见气道平滑肌外层、粘膜下层和外层可见大量炎性细胞浸润（Fig1），粘膜杯状细胞增多（Fig2），大气道周围形成较多的淋巴样结节组织，可见大量嗜酸性细胞，支气管平滑肌增厚，管壁环行肌肥大.
　　2.2 正常小鼠呼吸道CGRP┐IR阳性纤维分布特点 从支气管至终末细支气管和肺血管均可见CGRP-IR阳性纤维分布，而呼吸性细支气管和肺泡则未见阳性纤维.其分布特点是:①纤维主要分布于基底膜下及平滑肌外层周围;②主要分布于肺内支气管气道粘膜下层（Fig3）及细支气管粘膜下层（Fig4）及平滑肌层，随气道口径的变小，纤维密度逐渐减少;③纤维稀疏，呈串珠样或节状膨体.
　　
　　2.3 哮喘小鼠呼吸道CGRP┐IR阳性纤维分布特点 哮喘组与正常对照组呼吸道CGRP-IR阳性纤维分布相似，但亦有如下特点:①哮喘组肺内支气管及细支气管阳性纤维增粗、分布密集度显著增加（Fig5，6）;②在呼吸性细支气管及肺泡亦偶有分布（Fig6）;③有部分阳性纤维向粘膜上皮内长出并暴露于 管腔内.
　　
　　2.4 肺内支气管CGRP┐IR阳性纤维分布的记数 哮喘小鼠肺切片显示在气道口径d≥0.35mm和d≤0.35mm的范围内CGRP-IR阳性纤维数分别为（40.6±16.8）条/mm2 和（6.6±2.0）条/mm2 ，明显多于对照组（25.3±6.4）条/mm2 和（3.5±0.6）条/mm2 .相差显著（P&<0.01）.
　　
　　3 讨论
　　
　　CGRP是非肾上腺素能非胆碱能系统的主要兴奋性递质之一，广泛分布于气管、支气管和肺的无髓感觉神经C纤维中，参与肺功能的调节作用.既往研究表明CGRP具有使气道平滑肌收缩、促进淋巴细胞增殖、血管扩张、通透性增加及粘膜腺体分泌增多等多种作用［3-5］ .这与哮喘的病理特征一致，因而推测CGRP与哮喘发病有关.关于CGRP的作用方式，目前认为有经轴索反射的直接途径和经反射弧通过传出神经-迷走神经的间接途径.有研究显示哮喘患者和模型动物的血浆和BAL中有显著的CGRP含量改变，尽管这些结果并不一致［1，6，7］ .我们的实验发现哮喘小鼠肺内支气管CGRP-IR阳性纤维明显多于对照组，提示CGRP直接或间接参与哮喘的病理生理过程.关于CGRP-IR阳性纤维增多的原因考虑为:①cgrp基因表达增多.这可能包括两方面的因素:由于炎性细胞释放嗜酸性阳离子蛋白等产物，使气道上皮细胞损伤、脱落，导致气道上皮内或上皮下的感觉神经末梢裸露，呈现出对刺激的过度敏感状态，当受到各种物理和化学介质的刺激及各种炎性因子作用时，致cgrp基因表达量增加，导致免疫组化CGRP-IR纤维数量增多，CGRP免疫反应信号增强.这可以解释在激发试验时哮喘患者比正常人更容易发生气道高反应现象.另一种可能是CGRP的降解减少.

CGRP等感觉神经肽在气道主要被中性内肽酶（neutral endopeptidase，NEP）降解，NEP主要由气道上皮细胞合成，哮喘发作时由于炎症使上皮细胞脱落，导致NEP产生减少，从而使CGRP降解减少，局部CGRP堆积，反射性抑制感觉神经释放CGRP，致使CGRP在神经末梢周围处于相对积聚状态，但有实验已经证实，豚鼠哮喘状态下迷走神经处于高兴奋状态［8］ ，且实验中取材是在哮喘发作停止1h后进行的，因此CGRP不可能在末梢中积聚.②感觉神经增生.这应该是哮喘小鼠肺内CGRP-IR阳性纤维增多的最直接解释.在哮喘发病时患者的BAL和血液中检测到NGF水平明显升高［9］ ;还有通过与呼吸系统特异性转录调控因子联合NGF基因的转基因小鼠发现:高水平的NGF导致了气道的感觉神经过度支配，而高感觉神经支配的气道对外界刺激引起的增加呼吸系统阻力的作用更加敏感;而在应用NGF受体拮抗剂造成低神经支配的气道对外界刺激的敏感性降低［10］ ;有文献报道处于再生的神经元或纤维兴奋性是增高的并处于较高自发放电状态［11］ ，因此可能CGRP纤维在哮喘发作中处于增生状态.还发现与哮喘有关的IL-4，IL-5，IL-6，IL-12，IL-13等炎症因子都是较强的神经再生促进因子.有研究指出炎症细胞所释放的神经生长因子，可以刺激CGRP能神经纤维的增生［12］ .在我们后续实验中已经发现豚鼠哮喘发作后气管粘膜下有大量生长相关蛋白（GAP-43）免疫阳性纤维出现，实验中观察到的CGRP免疫阳性纤维增多以及部分纤维向管腔内伸展很可能是通过这些因素引起的.
　　
　　图1 － 图6 略
　　
　　综上所述，哮喘小鼠气道免疫性炎症可能刺激CGRP能神经纤维增生、神经纤维的敏感性增强，释放过量CGRP，而过多的CGRP又使气道炎症反应加剧，两者互为因果，这可能是使哮喘得以延续和发展的重要原因之一.
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