作者：韩泉洪 杜红俊 惠延年 马吉献
【关键词】 巨噬细胞
关键词: 巨噬细胞;视网膜色素上皮细胞;单核细胞趋化蛋白-1;地塞米松;道诺霉素
摘 要:目的 评价巨噬细胞调理液（MCM）对视网膜色素上皮（RPE）细胞合成单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的作用. 方法 在培养的人RPE细胞的培养液中加入200mL・L-1 培养人巨噬细胞调理液（MCM），培养2，4，8，16，24和48h后，对培养的细胞进行免疫组化和原位杂交，用Western blot检测培养的上清液中MCP-1的含量.同时在培养液中加入地塞米松（10-8 ，10-7 和10-6 mol・L-1 ）和道诺霉素（2，20和200mg・L-1 ）重复上述实验，观察在此条件下MCM对MCP-1合成的作用. 结果 200mL・L-1 MCM培养条件下RPE细胞2h时已检测出分泌的MCP-1并在16h达到较高水平.同时原位杂交和免疫组化在细胞中检测到MCP-1的表达.加入地塞米松（P&<0.01）和道诺霉素（P&<0.05）后，MCP-1的分泌水平明显降低，其中地塞米松对MCP-1合成的抑制作用大于道诺霉素. 结论 MCM刺激RPE细胞产生MCP-1，而MCP-1对巨噬细胞和淋巴细胞有较强的趋化作用，这种循环相互作用的过程对增生性玻璃体视网膜病变的发生可能有重要的作用.在视网膜脱离后尽早使用地塞米松可能对抑制增殖性玻璃体视网膜病变有作用.
Keywords:monocyte chemotactic protein-1;macrophages;retinal pigment epithelial cell;dexamethasone;daunorubicin
Abstract:AIM To examine the effects of cultured macrophage conditioned media（MCM）on production and gene expression of monocyte chemotactic protein-1（MCP-1）of human retinal pigment epithelial（HRPE）cell.METHODS HRPE were cultured with300mL・L-1 macrophage condi-tioned media（MCM）for2，4，8，24or48h，and with addi-tional dexamethasone（10-8 ，10-7 ，10-6 mol・L-1 ）or daunorubicin（2，20，200mg・L-1 ）.Secreted MCP-1in the supernatant of cultured RPE was measured using Western blot assay，and intracellular MCP-1was detected by in situ hybridization and immunohistochemistry.RESULTS Secret-ed MCP-1was detected with300mL・L-1 MCM for2hours after incubation，and reached the most intensity at16hours.MCP-1in cytoplasm was noted during the same time.The levels of MCP-1in cultures with Dexamethasone（P&<0.01）or Daunorubicin（P&<0.05）were decreased simultaneously.Dexamethasone showed a stronger effect than Daunorubicin.CONCLUSION MCM can stimulate RPE to produce MCP-1which in turn can recruit macrophage into the inflammatory area.This may imply an loop interaction in the procedure of PVR.Early treatment with Dexamethasone may be helpful in preventing the occurrence of proliferative vitreoretinopathy.
0 引言
视网膜脱离后发生的一个重要变化就是血-视网膜屏障的破坏，血浆成分和炎症细胞可以借此进入视网膜下腔参与视网膜脱离后的炎症过程［1］ .对新鲜视网膜脱离后视网膜下液中的细胞成分进行分析，发现其中的主要成分是巨噬细胞和淋巴细胞［2］ .巨噬细胞在增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）中有重要作用［3］ ，但巨噬细胞参与PVR形成中的作用机制还没有详细地得到揭示.单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）是参与炎症过程的一种重要炎症细胞趋化因子，其靶细胞是巨噬细胞和淋巴细胞，在临床和实验研究中，发现PVR的前膜组织中存在这种因子［4］ .本实验的目的是研究巨噬细胞的培养调理液对视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞合成MCP-1的作用，以及地塞米松和道诺霉素对这一过程的影响.
1 材料和方法
1.1 材料 细胞系为原代培养人RPE细胞.由本院王雨生副教授惠赠4个不同人来源的第四代RPE细胞作为实验细胞.
1.2 方法
1.2.1 巨噬细胞调理液（MCM）的制备 取肝硬化患者的腹水200mL，1000r・min-1 离心5min，制成细胞悬液，孵育，24h后用Hank’s液冲洗未附壁细胞，48h用胰蛋白酶消化去除成纤维细胞.1mL・L-1 利多卡因Hank’s液孵育解除附壁;制成（3.8～5）×1010 ・L-1 细胞悬液孵育36h后，取细胞培养液，针头滤器过滤，-20℃保存备用.
1.2.2 RPE细胞爬片制备和培养上清液的收集 RPE培养于盖玻片上至细胞铺满.次日加入含200mL・L-1 MCM的DMEM，另设地塞米松条件组（DEX，10-8 ，10-7 ，10-6 mol・L-1 ）和道诺霉素条件组（2，20，200mg・L
-1 ）重复上述实验.分别于加药后2，4，8，16，24和48h取出细胞爬片，PBS漂洗，多聚甲醛固定，空气干燥，-20℃保存备用.不加处理因素的作为正常对照组.在75mL培养瓶中，待RPE细胞生长满瓶底后，重复上述刺激条件，并在相应时间点收集细胞培养的上清液，-80℃保存待用.
1.2.3 原位杂交染色 地高辛标记MCP-1的DNA探针（大连宝生物公司，中国）序列为5’-TTG-GGT-TTG-CTT-GTC-CAG-GTG-GTC-CAT-GGA-3’.原位杂交试剂盒购自博士德公司（中国）.细胞爬片灭活内源性过氧化物酶，1∶200蛋白酶K消化10min，滴加含探针的原位杂交液，杂交24h，洗涤，封闭，滴加小鼠抗地高辛抗体、生物素抗羊化小鼠IgG，加入显色剂后显微镜下控制显色.水溶性封片剂封片，镜检.
1.2.4 免疫组织化学染色 试剂盒购自中国博士德公司.细胞爬片用正常羊血清封闭，滴加小鼠特异性抗体（抗人MCP-1抗体，美国PharMingen公司），4℃过夜，漂洗后顺序滴加生物素化羊抗小鼠IgG和SABC复合剂，加入显色剂后显微镜下控制显色.水溶性封片剂封片，镜检.
1.2.5 Western blot分析 RPE细胞培养上清液样品100μL，阳性对照用重组人MCP-1（美国Promega公司）10μg・L-1 .用SDS-PAGE分离蛋白后，放入电转移装置中，使胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，4℃转移过夜，丽春红S蛋白染色，脱色，照相，将分子量标准染色.将滤膜放在塑料袋中，封闭1h，加入稀释的第一抗体，PBS漂洗，加入辣根过 氧化物酶标记的第二抗体，加入DAB显色2～3min，水洗中止反应，照相.
结果分析:分析处理组阳性（显色）条带的蛋白表达量.用HP IAS-1000高清晰度彩色病理计算机图像分析系统根据信号的强弱分析蛋白的表达量，以灰度表示强弱（灰度值愈大表示愈强，分级256）.阳性对照条带的灰度值设为100%，其他条带的灰度经测量后，以对照条带比对的百分数表示.
统计学处理:对不同培养条件下，RPE上清Western blot条带的灰度值进行t检验.
2 结果
2.1 原位杂交 MCP-1的mRNA表现为细胞胞质中浓淡不一的紫蓝色着色，其中在巨噬细胞调理液刺激下，2h组表现为较浅的着色，4h组开始出现明显的着色，随着时间的延长，细胞质中的着色逐渐加深（Fig1）.
2.2 免疫组化 细胞内的MCP-1表现为胞质中浓淡不一的棕色着色.4h组开始有明显的着色，随着时间的延长，细胞质中的着色逐渐加深（Fig2）.
图1 － 图2 略
2.3 Western blot检测 表明培养的人RPE细胞在未无刺激的条件下，MCP-1的表达为阴性，200mL・L-1 MCM培养条件下，2h时已检测到MCP-1，而且随着时间延长而增多，并在16h达到较高水平（Fig3A）.加入DEX后，MCP-1分泌的高峰值明显下降（P&<0.01），10-6 mol・L-1 地塞米松组为无DEX水平的57%，而且出现高峰值的时间延长为24h（Fig3B）;而且这种作用呈现剂量依赖性，10-8 ，10-7 和10-6 mol・L-1 的地塞米松条件下为无地塞米松组的87%，68%和57%.较低剂量道诺霉素组能够轻度降低MCP-1的合成（P&<0.05），并使高峰值后延到24h以后（Fig3C）.高剂量（200mg・L-1 ）的道诺霉素作用下，培养细胞出现胞质内空泡以及部分细胞死亡.
3 讨论
本研究结果表明20%MCM条件下可以促进RPE细胞合成MCP-1，并呈现时间依赖性.地塞米松和道诺霉素可以抑制MCM的这种作用，地塞米松的作用明显而持久，并呈现剂量依赖性;而道诺霉素可以轻度降低MCP-1的合成.二者均可使MCP-1分泌的时限后延.以往PVR病理证实，在PVR的视网膜前膜中有RPE细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞样细胞、巨噬细胞样细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等多种细胞成分［5］ .巨噬细胞在PVR的发病过程中有一定的作用:首先它是普通炎症反应中较早出现在炎症部位的炎细胞，它主要负责吞噬细胞的碎片.同时培养的巨噬细胞可以产生许多炎前性因子，如:TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-8等［6］ .
MCP-1作为一种趋化因子，可以特异地趋化巨噬细胞和淋巴细胞到炎症部位，而参与炎症反应.在临床和实验研究中，发现PVR的前膜组织中存在这种因子［4］ ，同时在PVR和视网膜脱离后的玻璃体中可以检测到，而患者的血液中为阴性，说明其产生是 一种局部的反应.眼内细胞包括RPE细胞和胶质细胞在TNF-α和IL-1β的刺激下，可以产生MCP-1，IL-8和某些生长因子如转化生长因子-β（TGF-β）等［7］ .而这些生长因子又可以促进RPE细胞的增殖.在这样的一个循环过程中，由巨噬细胞游走向炎症部位聚集开始，自分泌炎前性因子TNF-α和IL-1β，这些因子又可以刺激眼内细胞产生MCP-1，从而有更多的巨噬细胞向炎症部位聚集，从而进一步放大了炎症过程，同时产生的生长因子又可以刺激RPE细胞和胶质细胞的增殖.由于我们实验中取材于肝硬化腹水患者腹水中的巨噬细胞，取材的数量有限，而且巨噬细胞是一种终末细胞，本身不能繁殖，所以定量测量MCP-1mRNA的表达方法如:Northern Blot较困难.我们通过Western blot方法检测培养RPE细胞上清中MCP-1并对条带的浓度进行比对，发现在200mL・L-1 作用下，RPE细胞分泌的MCP-1呈时间依赖性，这个作用通过原位杂交和免疫组化的结果得到验证.
地塞米松和道诺霉素对抑制眼内炎症［8］ 和PVR［9］ 的作用已经在实验和临床上得到证实［10］ ，我们的结果表明二者对炎症早期趋化因子的合成有抑制作用，其作用机制可能是通过抑制MCP-1的mR-NA合成［11］ 和抑制细胞的生长起作用.地塞米松对培养RPE细胞的毒性较小，而且作用呈剂量依赖性增强.大剂量的道诺霉素对培养的RPE细胞有一定的毒性作用.临床上将二者合用可能对抑制眼内炎症和PVR发生的早期过程有较好的治疗作用.
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