【关键词】 鼻窦炎
关键词: 鼻窦炎;肺炎链球菌;鼻窦粘膜;家兔
摘 要:目的 建立家兔实验性急性、慢性鼻窦炎模型，观察其细菌学和组织形态学变化. 方法 家兔24只，在全麻下，行上颌窦造口术，阻塞窦口，留置棉绒，结合接种1011 cfu肺炎链球菌0.4mL.术后5，35d行细菌学和病理形态学检验. 结果 急性鼻窦炎组家兔感染的鼻窦可见多量中性粒细胞、嗜酸性粒细胞渗出液，粘膜可见淋巴细胞、浆细胞浸润，粘膜水肿，部分腺上皮变性坏死.慢性组家兔所有感染的鼻窦均表现出中度或重度的炎症，典型特征是纤毛损坏，脱屑，上皮组织化生，而且出现白细胞浸润，纤维化，骨膜增生和骨质退化.造模的所有16只家兔上颌窦细菌培养阳性率为100%，而正常组细菌培养结果为阴性. 结论 成功建立了稳定可靠的家兔急性、慢性鼻窦炎模型.
Keywords:sinusitis;streptococcus pneumoniae;sinus mu-cosa;rabbit
Abstract:AIM To establish an animal model for acute and chronic sinusitis in rabbits and to observe their mucosa and mucociliary change.METHODS Experimental sinusitis was induced in rabbits by blocking the osmium and occluding with cotton packs and inoculating1011 cfu streptococcus pneumoniae in0.4mL.The animals were examined histologically and bacteriologically after5and35days.RESULTS The actue model produced a sinus infection that was characterized by exudates of neutrophils and eosinophils，mucosal infiltration with lymphocytes and plasma cells，and epithelial degenera-tion.The infected sinuses of chronic model displayed signs of moderate or severe inflammation throughout the study peri-od.Ciliary damage and desquamation，hyperplasia and meta-plasia of the epithelium were characteristic features.Further-more，heavy leukocyte cell-infiltration，fibrosis，periosteal hyperplasia and bone degradation and formation were also frequently encountered.There was a100%correlation rate between culture of specimen obitain from the maxillary sinus in all16animal of AS group and CS group.Normal animals showed no bacterial growth from the maxillary sinus.CONCLUSION Stable acute and chronic sinusitis model can be established by using the method mentioned above.
0 引言
鼻窦炎是临床常见病、多发病，其人群发病率为15%［1］ .急性鼻窦炎（acute sinusitis，AS）普遍应用抗生素治疗［2］ .慢性鼻窦炎（chronic sinusitis，CS）是由细菌、病毒、免疫功能紊乱［3］ 等多因素作用的结果，尤为难治，常反复发作，缠绵难愈.目前国内外尚无治疗本病确切有效的药物，仍以抗生素，手术疗法及对症治疗为主.若建立鼻窦炎的动物模型，就能够更好地筛选抗生素，改进手术方案及开展中医药药理研究，势必能改善目前的治疗状况，为科学研究和临床治疗创造条件，奠定基础.鼻窦炎的致病菌多为肺炎链球菌（40%），葡萄球菌［4］ ，流感嗜血杆菌等需氧菌及厌氧菌［5］ .肺炎链球菌是常见病原菌［6］ .家兔对肺炎链球菌易感，故我们采用鼻窦造口术结合接种肺炎链球菌［7］ ，并将堵塞窦口［8］ 与留置棉绒方法［9］ 结合应用.
1 材料和方法
1.1 材料 雄性健康大耳白家兔24只，体质量2.5～3.0kg，随机分为3组，每组8只，即正常组、急性鼻窦炎组（AS）、慢性鼻窦炎组（CS）.实验前，动物在标准环境下饲养1wk.整个实验过程中，动物自由饮水，青颗粒料喂养.从门诊患者的鼻咽分泌物中分离筛选出单一菌株strep pneumoniae.因肺炎链球菌对人和动物的致病力，皆是荚膜型优于无荚膜型，故有荚膜的肺炎链球菌被分离，培养，收集.将荚膜型菌接种于5个密封的家兔鼻窦内，4d后，从这些鼻窦的2个中分离pneumoniae type-3，9，19，和23.致病力最强的type-3被挑选出来，用于诱导家兔鼻窦炎［10］ .为了保存其致病力，菌株可保存在-20℃下，加150mL・L-1 甘油的血清葡萄糖培养基中（-70℃可长期保存）.细菌被接种于血平板上，置于37.5℃CO2 培养箱中24h.从血平板上收集菌落，连续稀释，制成1011 cfu・L-1 混悬液备用.
1.2 方法 术前1d，将家兔鼻背正中的毛剪短，脱掉.用200g・L-1 乌拉坦5mL・kg-1 行ip麻醉，20～30min后，动物行自主呼吸.常规消毒，披盖洞巾，沿鼻背正中线切一纵长开口，剥离皮下组织和骨膜，用骨钻钻4mm×4mm的孔，用无菌棉签取窦内分泌物作培养.用生理盐水冲洗窦内粘膜，以防干燥.在手术内窥镜下，通过上颌窦上壁，暴露窦腔粘膜和上颌窦窦口裂隙，用棉绒阻塞窦口，并在窦腔内留置棉绒，缝皮.整个过程必须严格无菌操作.第2日，在无菌条件下，从鼻窦造口处用1mL注射器向窦腔内注入1011 cfu肺炎链球菌0.4mL.正常组分别于术后5，35d，AS组于5d，CS组于35d，在全麻下，打开窦腔取材.
1.2.1 细菌分离培养 无菌棉签取窦内分泌物作细菌分离培养，于血平板上置37℃厌氧和需氧培养箱中24h，涂片，革蓝染色，镜检，作鉴别实验.
1.2.2 组织形态学 光镜:取鼻鼻窦，固定于40g甲醛中，脱钙，脱水，石蜡包埋，连续切片，HE染色，镜检（LM）.扫描电镜:为避免血液污染粘膜，动物行心脏穿刺放血，当粘膜变白时，快速打开窦腔，用生理盐水快速、充分地冲洗粘膜，然后向其表面滴加数滴25g・L-1 戊二醛溶液.10min后，切下粘膜，固定于戊二醛中，10g・L-1 四氧化锇后固定2h，乙醇梯度脱水，临界点干燥，培金，日立S-450扫描电镜观察.
2 结果
2.1 细菌分离培养 造模的所有16只家兔上颌窦细菌培养阳性率为100%，而正常组细菌培养结果为阴性.术后5d，AS组6只家兔分离培养出肺炎链球菌，而术后35d，CS组只有1只培养出此菌.在感染的鼻窦中还分离培养出其他7种杆菌和球菌，分别是 甲族溶血性链球菌、流感杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯菌、脑膜炎球菌等.其中金黄色葡萄球菌在所有造模动物的鼻窦中皆分离培养出.AS组中5只家兔鼻窦中培养出绿脓杆菌，而CS组为8只（Tab1）.
表1 家兔24只窦腔细菌分离培养结果 略
表2 家兔鼻窦粘膜半量化等级病理结果 略
2.2 组织形态学 光镜下正常组家兔鼻窦粘膜由假复层纤毛上皮构成，排列整齐，粘膜下无充血，腺体散在分布，偶见杯状细胞.AS组家兔感染的鼻窦可见多量中性粒细胞、嗜酸性粒细胞渗出液，窦腔粘膜可见杯状细胞，淋巴细胞、浆细胞浸润，粘膜水肿，部分腺上皮变性坏死.CS组家兔所有感染的鼻窦均表现出中度或重度的炎症，可见粘膜上皮增生、肥厚，排列不整齐，部分已变性，坏死，脱落，有小溃疡形成，粘膜水肿，可见大量杯状细胞，有大量淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞浸润，由于粘膜剧烈水肿，部分动物形成息肉，纤维组织增生，骨膜增厚，部分骨质被吸收，导致窦壁骨质变薄（Tab2）.扫描电镜下正常组粘膜纤毛密集、均匀、方向一致，横断面为典型的9+2结构.AS组粘膜纤毛轻中度破坏，倒伏，部分细胞纤毛脱落.CS组粘膜纤毛稀疏，倒伏，脱落，可见多个裸露的纤毛上皮细胞，上皮细胞破坏，可见单细胞移位或缺失和脱落的粘膜碎屑，纤毛横断面肿胀，呈颗粒样变性，9+2结构消失.
3 讨论
急性鼻窦炎是鼻窦粘膜的急性炎症，常见的致病菌为肺炎链球菌、葡萄球菌、变形杆菌、流感杆菌等，常为混合性感染.慢性鼻窦炎多由急性发展而来，是指症状和体征持续8wk以上和反复发生的急性鼻窦炎每年发作4次以上，每次至少持续10d［11］ .鼻窦炎是一个有显著发病率和相当长发病期的疾病，其发病因素极其复杂，归纳如下:①病原微生物感染:约80%以上的病变鼻窦标本中能培养出细菌，主要为肺炎链球菌（40%），流感嗜血杆菌（35%），金黄色葡萄球菌等需氧菌及厌氧菌（7%～80%）.细菌可通过荚膜、鞭毛等自身毒力，以及所释放的毒素、胶原酶和蛋白酶等侵袭粘膜上皮，趋化中性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞，促进前列腺素、组胺等递质的释放，导致粘膜损伤和疾病的发展.慢性鼻窦炎单独使用抗生素治疗往往难以取得满意的效果，很可能细菌感染在发病中并非首要因素，但细菌侵袭粘膜引起的炎性破坏仍是发病的重要环节;20%合并病毒感染;由于抗生素的不合理应用或自身免疫力低下，自发真菌感染者日益增多［12］ ;②窦口鼻道复合体阻塞是鼻窦炎发病的关键因素［13］ :窦口鼻道复合体阻塞导致PaO2 的下降，PaCO2 的上升和粘膜血流的下降，从而使一些毒力较弱的细菌大量繁殖，对粘膜及粘膜下层侵袭，引起炎性反应［14］ .当炎症未及时控制时，便会导致结缔组织增生及磷状上皮化生，进一步加重窦口鼻道复合体的阻塞;③粘膜纤毛功能障碍（尤其是继发性纤毛功能障碍）:纤毛形态结构损伤:由细菌及其毒素、酶，炎性细胞及炎性递质损伤所致的纤毛形态结构损伤，如纤毛排列紊乱，纤毛及纤毛柱状细胞缺失，鳞状上皮化生，纤毛失方向性及短纤毛再生等.这种改变与疾病严重程度明显相关，而且改变越严重，粘膜纤毛运动输送功能越差.纤毛摆动频率与扫描电镜观察到的纤毛上皮损害密切相关;纤毛运动功能减弱:一些细菌（如绿脓杆菌、流感嗜血杆菌等）可释放某些因子使纤毛运动下降，摆动紊乱;从中性粒细胞释放出的蛋白溶酶不仅造成纤毛结构损伤，还可使纤毛运 动停止，窦腔PaO2 的下降，PaCO2 的上升，使得纤毛上皮ATP产生减少，进而纤毛运动能力下降.鼻腔异物、鼻息肉、局部阻塞可使纤毛运动能力下降.粘膜纤毛功能障碍，使机体不能有效地清除有毒物质，导致了疾病的发生发展;④免疫功能紊乱是慢性鼻窦炎的一个重要发病因素，免疫缺陷:一般IgA，IgG IgE［15］ 缺乏，低丙种球蛋白血症及多变型免疫缺陷病等均与CS发病有关
国内有关鼻窦炎的动物实验研究鲜有报道，鼻窦炎动物模型亦未见文献记载.国外报道的造模方法，多以细菌诱导为主，以肺炎链球菌诱导为多，也有以金黄色葡萄球菌、脆弱杆菌［19］ 诱导者.一般采用直接向窦腔内注入细菌，而不堵塞窦口，由于引流通畅，细菌很快从窦口流出，留滞时间过短，不易成功.有些学者单纯采用堵塞窦口法，而不接种细菌，依靠窦口阻塞导致的引流不畅来造模，成功率低，且造模周期长.为了诱发超敏反应，有学者用卵清蛋白致敏法，但易形成皮肤疖肿，且方法繁琐，操作不便.本造模方法根据鼻窦炎的发病机制，针对细菌感染、窦口鼻道阻塞、窦腔内环境异常、粘膜纤毛清除功能障碍等多个主要发病环节，采用鼻窦造口术结合接种肺炎链球菌，并将堵塞窦口与留置棉绒方法结合应用.采用堵塞窦口法，有效地阻止了细菌外流，显著地延长了细菌停滞时间［10］ ，同时又导致了窦内通气、引流停滞，利于细菌生长繁殖;同时结合留置棉绒，使细菌与窦腔粘膜充分接触，而且异物还可加重炎症反应，诱导超敏反应［20］ ，引起免疫功能紊乱，从而大大地缩短了造模时间.大多学者报道慢性鼻窦炎造模时间为9～40wk，而本方法只用5wk即可成型.且模型稳定，可重复性强.
致 谢 辽宁中医学院刘学文教授、张永志教授，中国医科大学刘瑞德教授给予的指导.
参考文献:
［1］Kaliner MA.Sinusitis:Bench to bedside ［J］.Otolaryngol Head Neck Surg，1997;100（4）:510.
［2］Chen FQ，Huang WG，Qiao L，Huang H，Qiu JH，Zhang S.Endoscopic surgery for paranasal sinus mucocele ［J］.Di-si Jun-yi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（6）:S134.
［3］Liu AR，Sun B，Zhu P，Zhang H，Wang YH.IL-12affects Th1/Th3cells of patients with asthma ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（9）:1159-1160.
［4］Beste DJ，Capper DT，Shaffer K，Kehl KS，Kajdacsy B.An-timicrobial effect on rabbit sinusitis after temporary ostial occlu-sion ［J］.Am J Rhinol，1997;11（6）:485-489.
［5］Biel MA，Brown CA，Levinson BM，Garvis GE，Paisner HM，Sigel ME，Tedford TM.Evaluation of the anicrobiology of chronic maxillary ［J］.Ann Otol Rhinol Laryngol，1998;107（11）:942-945.
［6］Jin FG，Zhang YQ，Liu TG，Xiao Y.Clinical character and risk factors of nosocomical pneumonia in the chronic pulmonary heart disease ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（4）:470-471.
［7］Bomer K，Brichta A，Baroody F，Boonlayangoor S，Li X，Na-clerio RM.A mouse model of acute bacterial rhinosinusitis ［J］.Arch Otolaryngol Head Neck Surg，1998;124（11）:1227-1232.
［8］Jyonouchi H，Sun S，Kennedy CA，Rimell FL.Interferon gam-ma levels in the sinus，ear，and airway in a rabbit sinusitis model induced by Bacteroides inoculation ［J］.Arch Otolaryngol Head Neck Surg，2000;126（4）:529-532.
［9］Marks SC.Acute sinusitis in the rabbit:A new rhinogenic mod-el ［J］.Laryngoscope，1997;107（12）:1579-1585.
［10］Gnoy AR，Gannon PJ，Ganjian E，Fliegelman L，Farber D，Sil-vers A，Lawson W.A potential role for nasal obstruction in de-velopment of acute sinusitis:An infection study in rabbits ［J］.Am J Rhinol，1998;12（6）:399-404.
［11］Clement PAAR，Bluestone CD，Gordts F.Management of rhi-nosinusitis in children ［J］.Arch Otolaryngol Head Neck Surg，1998;124（1）:31-34.
［12］Schubert MS.Medical treatment of allergic fungal sinusitis ［J］.Ann Allergy Asthma Immunol，2000;85（2）:90-97.
［13］Berglof A，Norlander T，Feinstein R，Otori N，Stierna P，Sandstedt K.Association of bronchopneumonia with sinusitis due to Bordetella bronchiseptica in an experimental rabbit model ［J］.Am J Rhinol，2000;14（2）:125-130.
［14］Yan JQ，Zhen J，Zhang ZY，Yang P.CT corona scanning graph analysis on fighter aviator’s paranasal sinuses ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（6）:670-673.
［15］Christodoulopoulos P，Cameron L，Durham S，Hamid Q.Molecular pathology of allergic disease II:Upper airway disease ［J］.J Allergy Clin Immunol，2000;105（2）:211-223.
［16］Demoly P，Bencherioua AM，Crampette L，Dhivert-Donnadieu H，Godard P，Michel FB.From allergic rhinitis to sinus dis-eases（sinusitis/nasal polyps）:Epidemiologic and experimental links ［J］.Rev Mal Respir，2000;17（5）:925-930.
［17］Stach SL.Improving self-care in adults with asthma using peak expiratory flow rate home monitoring ［J］.J Am Acad Nurse Pract，2000;12（2）:59-70.
［18］Lu KJ，Wei HW，Li YS，Wang W，Li HZ，Hu M.Correlation-ship between the infiltration of inflammatory cells within airway and the expression of oncogene c-jun in asthmatic guirea pig model ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1997;18（1）:29-32.
［19］Jyonouchi H，Sun S，Kennedy CA，Roche AK，Kajander KC，Miller JR，Germaine GR，Rimell FL.Localized sinus inflamma-tion in a rabbit sinusitis model induced by Bacteroides fragilis is accompanied by rigorous immune responses ［J］.Otolaryngol Head Neck Surg，1999;120（6）:869-875.
［20］Jyonouchi H，Sun S，Kennedy CA，Kajander KC，Rimell FL.IgG antibody levels in the sinus，ear，and airway in a rabbit model of sinusitis with Bacteroides ［J］.Arch Otolaryngol Head Neck Surg，1998;124（7）:767-772.