作者：王占明 鲁建国 赖大年 包国强 马庆久 吴金生
【关键词】 缺血预处理
关键词: 缺血预处理;热休克蛋白70;缺血-再灌注损伤
摘 要:目的 研究缺血预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤后延迟保护效应的机制. 方法 建立大鼠肝脏缺血再灌注模型并进行缺血预处理，实验分组如下:①假手术组（Sham-op-eration，S组）;②缺血再灌注组（ischemic reperfusion，I/R组）;③缺血预处理组（ischemic preconditioning，PC组）;④预处理加左旋硝基精氨酸组（preconditioning+L-NNA，PC+L组），各组再灌注后检测血清谷丙转氨酶（alanine aminotrans-ferase，ALT）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、热休克蛋白70（HSP70）免疫组化染色，肝组织石蜡切片HE染色及电镜观察. 结果 PC组ALT及MDA含量明显低于I/R组（P&<0.01），肝组织损伤程度明显减轻;PC+L组在0～3h阶段ALT和MDA含量与I/R组无显著区别（P&>0.05），而在6～48h阶段则显著低于I/R组（P&<0.01）但仍高于PC组（P&<0.05）.HSP70免疫组化染色:PC组、PC+L组3～48h染色阳性率逐渐增多并显著高于I/R组（P&<0.01）. 结论 NO和HSP70均对大鼠肝脏缺血再灌注损伤具有保护作用，HSP70可能是导致延迟保护效应的重要因素.
Keywords:ischemic preconditioning;heat shock proteins;is-chemia-reperfusion injury
Abstract:AIM To assess the protection of HSP70’s and time course in the preconditioning（PC）in ischemia/reperfu-sion（I/R）injury in rat liver.METHODS 168SD rats were randomly pided into four groups:①S group:n=42，sham-operated control;②I/R group:n=42，subjected to ischemia for70min;③PC group:n=42，ischemia for5min and reperfusion for5min for twice，then subjected to is-chemia;④PC+L group:n=42，the rats were administered L-NNA（10mg・kg-1 ）before preconditioning，and then were subjected to ischemia for70min.Serum level of alanine aminotransferase（ALT）and malondialdehyde（MDA）was detected during reperfution.Expression of HSP70in hepatic cell was analysed by histochemical technique.RESULTS Serum level of ALT and MDA of both I/R and PC+L group increased，compared with PC group（P&<0.01）after reperfu-sion.There was not significant difference between I/R group and PC+L group during0～3h（P&>0.05）but there was during6～48h（P&<0.01）.The serum level of ALT and MDA was higher in PC+L vs PC group（P&<0.05）but lower than I/R group during6～48h（P&<0.01）.Expression level of HSP70in PC and PC+L group became gradually higher than I/R group during6～48h（P&<0.01）.CONCLUSION NO and HSP70might be involved in the protection against liver ischemia/reperfusion injury and HSP70might be associ-ated with the late preconditioning.
0 引言
自1986年Murry等［1］ 首次提出缺血预处理以来关于预处理的机制研究不是很清楚，有很多学说，其中不少学者认为预处理保护效应包括早期保护效应和延迟保护效应［2］ ，但延迟保护效应的详细机制仍不清楚，为了进一步探讨其机制，本实验在大鼠肝脏缺血再灌注模型的基础上作缺血预处理，并利用NO合成抑制剂L-NNA消除早期预处理效应［3］ ，通过检测血清ALT，MDA含量变化及肝组织HSP70的免疫组化染色，探讨延迟保护作用及机制.
1 材料和方法
1.1 材料 SD大鼠，雌雄不拘，动物购自本校实验动物中心，ALT试剂盒均购自北京北化精细化学品有限责任公司.MDA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;热休克蛋白70（HSP70）免疫组化染色系列SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，编号SA2077.
1.2 动物分组 SD大鼠168只，体质量180～220g，随机分为4大组:①假手术组（S组，n=42），仅开腹、关腹，不阻断肝脏血流;②缺血再灌注组（I/R组，n=42）:肝门阻断70min，持续再灌注;③预处理后缺血再灌注组（PC组，n=42）:阻断肝门，缺血5min后再灌注5min，共重复2次后阻断肝门，缺血70min，持续再灌注;④预处理加L-NNA加缺血再灌注组（PC+L组，n=42），预处理前在门静脉注射L-NNA（10mg・kg-1 ），然后与PC组同法，标本采集:再灌注后于0，1，3，6，12，24和48h取静脉血清及缺血部位肝脏组织标本，乙醇、甲醛液固定，每个时间点均为6只大鼠，每只大鼠只限取一次标本后处死.
1.3 模型制备方法 依照Kobayashi法建立大鼠肝脏局部缺血再灌注模型，每只大鼠手术前禁食12h，采用2g・L-1 戊巴比妥钠30mg・kg-1 腹腔内麻醉，正中剖腹，分离肝十二指肠韧带，暴露肝门部.S组不作进一步处理;所有缺血方法均为血管夹阻断门静脉进入肝脏第一次分叉以远，即阻断肝尾状叶及肝左叶血流，造成70%肝脏缺血，阻断达到所需的时间后，松开血管夹，进行再灌注.
1.4 指标检测
1.4.1 血清ALT，MDA的检测 下腔静脉血2mL常温1500r・min-1 离心3min，取血清，用赖氏法测定ALT活性.比色法测定血清MDA含量.
1.4.2 肝组织热休克蛋白免疫组化染色 各时间点采集的肝脏组织标本均进行热休克蛋白70（HSP70）免疫组化染色;采用生物免疫组织化学染色法，苏木素复染，高倍镜下，细胞质呈棕色着染者为HSP70蛋白表达阳性细胞，观察切片中10个具有代表性的高倍视野，计算1000个肝细胞中（100个细胞×10个高倍镜视野）染色阳性细胞数除以1000作为HSP70蛋白表达阳性率.
1.4.3 形态学检查 剪取肝左叶组织1.5cm见方的组织块，用甲醛液固定，制成石蜡切片，进行HE染色，镜下观察组织结构.另外各组3，12和24h组织块固定后送电镜观察.
统计学处理:全部数据以x ±s表示，均数间比较用t检验，采用SAS统计软件分析.
2 结果
2.1 各组大鼠再灌注后血清ALT及MDA变化 再灌注后各个时间点I/R，PC，PC+L组血清ALT，MDA含量明显增高（P&<0.01vs S组）;PC组明显低于I/R组（P&<0.01）;PC+L组则0～3h阶段与I/R组无显著差异（P&>0.05），6～48h阶段则显著低于I/R组（P&<0.01），但仍高于6～48h阶段的PC组（P&<0.05，Tab1）.
表1 再灌注后大鼠血清ALT及MDA变化 略
2.2 免疫组化染色结果 各组染色结果见Tab2:可见除S组外3h后均有染色，但I/R组阳性率显著低于PC及PC+L组（P&<0.01），PC组染色阳性率持续增高，48h已达本实验的最高点，PC组与PC+L组差异无统计学意义.
2.3 组织形态学改变 S组大鼠肝脏外观光亮红润.PC组肝脏与S组基本相同.I/R组肝脏呈深红色，并可见花白相间花斑状.HE染色切片:镜下可见S组肝细胞、枯否细胞及肝窦内皮细胞形态正常.I/R组肝细胞核大小不一、有多级核分裂相及染色质边集，可见多数肝窦扩张，周围有大量红细胞淤积，肝窦及毛细血管内有微血栓形成.随再灌注时间的延长，肝细胞肿胀、变性和坏死的程度和范围进行性加重，甚至在镜下难以看到完整的肝小叶结构.PC组组织结构破坏轻微仅见部分肝细胞轻度浊肿、偶有变性、坏死及肝窦间隙少量红细胞淤积，肝小叶结构基本完整;PC+L组的3h组与I/R组的3h组相近，损伤严重，PC+L组的12h及24h亚组则与PC组接近.
电镜结果显示，I/R组核膜增厚，染色质边集，呈高电子密度，线粒体明显肿胀，嵴断裂、消失，基质呈高度毛玻璃状（Fig1A）;PC组线粒体结构基本正常，但可见其肿胀，数量增多（Fig1B）;S组核膜正常，线粒体分布均匀，大小正常（Fig1C）;PC+L组则其3h组织结构与I/R组变化相近，12及24h组则接近于PC组.
表2 再灌注后肝脏细胞中HSP70的阳性表达率（略）
图1 略
3 讨论
缺血预处理对肝脏具有确切的保护作用，这已为大量的事实所证实，本实验结果表明:对大鼠肝脏进行缺血预处理可以大幅度减低缺血再灌注损伤后ALT的释放，进一步证实预处理对肝实质细胞具有保护作用，以往的实验大多集中在再灌注后0～3h进行各项指标检测，本实验结果显示在6～48h这一阶段预处理保护效应仍逐渐增强，提示了延迟保护效应存在的可能.
对于延迟保护的机制，Rizvi等［5］ 证实在兔心肌抑顿（myocardial stunning）延迟预处理中如果用环己氧胺抑制蛋白质合成则可以完全废除延迟预处理效应.Yellon等［6］ 认为与PC诱导某些内源性保护物质的合成有关，如热休克蛋白、抗氧化酶类、特殊糖蛋白等，而热休克蛋白70是生物界普遍存在的一种内源性保护物质，缺血、缺氧、热应激［7］ 等多种因素都可以引起它的高表达，其对动植物所表现出来的保护作用早已为大量的实验所证实.本研究中，热休克蛋白免疫组化染色结果提示PC组及PC+L组再灌注后6～48h大鼠肝组织中表达逐渐增多并显著高于I/R组（P&<0.01），提示HSP70参与了延迟保护效应，该结果与其他学者［8，9］ 在心肌的实验结果具有相似之处，但在动物肝脏缺血预处理方面仅见Saad等［10］ 报道预处理后有热休克蛋白的mRNA表达增多及免疫组化染色呈阳性，在证实热休克蛋白在缺血预处理中对肝脏延迟保护效应方面尚未有学者作进一步实验.
对于热休克蛋白在体内合成的启动因素可能是由于在应激状态下多种因子在细胞内激活了热休克蛋白的反式调控因子（HSF）也叫热休克因子，并由于热休克因子的磷酸化增强了HSF和热休克元件（HSE）的结合力，后者启动了HSP系列蛋白的合成，上述磷酸化过程所需要的磷酸化酶正是磷酸激酶C（PKC）和磷酸激酶A（PKA）［11］ ，而PKC则是预处理保护效应的共同途径［12］ .故有学者认为延迟预处理是由KATP 引发的由PKC介导来完成的［13］ ，与本实验其实相互印证.
缺血再灌注损伤主要是由于自由基的大量产生［14，15］ ，本实验预处理组血清MDA含量的变化结果表明不管早期还是延迟预处理保护效应可能都是通过激发机体内各种内源性保护机制，最终达到抑制和清除自由基、减轻了肝细胞膜的脂质过氧化反应而实现其保护效应［16］ .张德海等［17］ 也认为热休克主要通过诱导细胞内在的清除过氧化物类自由基的酶活性的增高增强了细胞抗氧化能力.
本实验结果中PC组的6～48h亚组所表现出来的保护效应好于同一时间段的PC+L组，提示仍然有NO参与延迟保护效应，但根据数据推测可能不占主要地位.究竟HSP70是否为延迟保护效应的主导因素以及与其他内源性保护因子之间的关系如何仍然值得进一步研究.所有这些实验将对以后的肝脏缺血预处理及其他内源性保护机制的进一步研究和临床应用具有一定的指导作用.
参考文献:
［1］Murry CE，Jennings RB，Reimer KA.Preconditioning with is-chemia:A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium ［J］.Circulation，1986;74（5）:1124-1136.
［2］Toshiyuki N，Shinya M，Kenshi F，Masatsugu H，Takayuki I.Evidence for the delayed effect in human ischemic precondition-ing ［J］.J Am Coll Cardiol，1999;34（7）:1966-1974.
［3］Guan YS，Lu XS.The effect of NO in ischemic preconditioning on liver ischemic reperfusion injury in rats ［J］.Zhonghua Pu-tong Waike Zazhi（Chin J Gen Surg），1998;7（6）:330-333.
［4］Carmen P，Georgina H，Daniel C，Emili G，Joan RC.Protective effect of preconditioning on injury associated to hepatic ischemia-reperfusion in the rat:Role of nitric oxide and adenosine ［J］.Hepatology，1997;25（4）:935-937.
［5］Rizvi A，Tang XL，Qiu Y，Xuan YT，Takano H，Jadoon AK， Bolli R.Increased protein synthesis is necessary for the develop-ment of late preconditioning against myocardial stunning ［J］.Am J Physiol，1999;277（3）:874-884.
［6］Yellon DM，Pasini E，Cargnoni A，Marber MS，Latchman DS，Ferrari R.The protective role of heat shock stresses in the is-chemic and reperfused rabbit myocardium ［J］.J Mol Cell Car-diol，1992;24（8）:895-907.
［7］Zhang SZ，Wang XP，Liu YF，Yang SJ，Sun YJ.Expression of70kd heat shock protein in cultured human live cancer cell SMMC-7721［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（9）:1164.
［8］Sun JZ，Tang XL，Knowlton AA，Park SW，Qiu Y，Bolli R.Late preconditioning against myocardial stunning:An endoge-nous protective mechanism that confers resistance to postis-chemic dysfunction24h after brief ischemia in conscious pigs ［J］.J Clin Invest，1995;95（1）:388-403.
［9］Nomura F，Aoki M，Forbess JM，Mayer JE.Myocardial self-preservative effect of heat shock protein70on an immature lamb heart ［J］.Ann Thorac Surg，1999;68（5）:1736-1741.
［10］Saad S，Kanai M，Awane M，Yamamoto Y，Morimoto T.Issel-hard W.Protective effect of heat shock pretreatment with heat shock protein induction before hepatic warm injury caused by pringle’s maneuver ［J］.Surgery，1995;118（3）:510-516.
［11］Holmberg CI，Roos PM，Lord JM，Eriksson JE，Sistonen L.Conventional and novel PKC isoenzymes modify the heat-in-duced stress response but are not activated by heat shock ［J］.J Cell Sci，1998;111（22）:3357-3365.
［12］Liu XH.A General biological phenomenon and its mechanisms ［J］.Shenli Kexue Jinzhan（Prog Physiol Sci），1998;29（1）:39-41.
［13］Takashi E，Wang M，Ashraf M.Activation of mitochondrial KATP+channel elicits late preconditioning against myocardial infarction via protein kinase C signaling pathway ［J］.Circ Res，1999;85（12）:1146-1153.
［14］Brrington P，Meier CF，Weglicki WB.Abnormal electrical ac-tivity induced by free radical generation systems in isolated car-diocytes ［J］.J Mol Cell Cardiol，1988;20（12）:1163-1168.
［15］Tao L，Li Y，Gao F，Wang YM，Gong WQ.Protective effect of ischemic postconditioning on rabbit hearts with acute myocardial ischemia and reperfusion ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（6）:S116-S118.
［16］Zhou X，Zhai X，Ashraf M.Direct evidence that initial oxidative stress triggered by preconditioning contributes to second window of protection by endogenous antioxidant enzyme in myocytes ［J］.Circulation，1996;93（6）:1177-1184.
［17］Zhang DH，Li ZX，Qian XM，He JH，Fong SS，Wang QC，Meng H.Heat shock can improve the activeties of myocardial antioxidase in canines subjected to myocardial ischemia-reperfu-sion injury ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（7）:S19-S20.