作者：颜真 王俊楼 王慧 韩苇 李波 赵宁 张英起
【关键词】 神经生长因子
关键词: 神经生长因子;小鼠;纯化;质量鉴定
摘 要:目的 研制小鼠神经生长因子（NGF）. 方法 采用二次阳离子柱层析法，从雄性小鼠颌下腺分离提取2.5S神经生长因子，建立了稳定的实验室与中试生产工艺，以及相应的质量鉴定规程. 结果 从体质量超过25g，鼠龄大于60d的雄性小鼠体内可获得高纯度、高产量、高活性的2.5S NGF.纯度大于95%，与抗2.5S NGF抗体有特异结合能力，鸡胚背根神经节培养法测定的生物活性显示，其比活性达到5×108 BU・g-1 （BU:生物活性单位）以上，各项指标均符合质量鉴定标准.20g・L-1 人血白蛋白做冻干赋形剂，能有效保护NGF的生物活性. 结论 研制了高质量的冻干小鼠神经生长因子，为NGF的临床前和临床研究奠定了基础.
Keywords:nerve growth factor;mouse;extraction;quality assurance
Abstract:AIM To investgate and put NGF on clinic.METHODS With technique of cation-exchange chromatog-raphy，the method of extraction and trial production of2.5S NGF from mouse submandibular glands was established.RESULTS The NGF extracted from mature male mice sub-mandibular glands（body mass&>25g，age&>60d）reached a high purity（&>95%），good biological activity（specific activi-ty&>5×108 BU・g-1 ）and high output（4mg NGF/100mice）.All the examines met our quality assurance standard.For lyophilization，20g・L-1 human sera albumin effectively protected the biological activity of NGF.CONCLUSION High qualified lyophilized mouse nerve growth factor has been produced，which has laid a foundation for further NGF application research.
0 引言
神经生长因子（nerve growth factor，NGF）是神经营养素家族中发现最早、研究最多的一种神经营养蛋白.其分子结构、理化性质、基因结构、主要生物学功能、受体的结构和性质等均己先后被阐明［1，2］ .NGF可促进中枢及外周神经系统的发育和分化，维持神经系统的正常功能，加快神经系统损伤后修复.越来越多的研究［3-7］ 表明，NGF与许多神经系统的病理改变有关，做为一种神经系统损伤后的治疗用药，NGF具有重要的开发和临床应用价值.我们探讨并建立了从成年雄性小鼠颌下腺分离纯化2.5S NGF的方法，并已完成中试放大工艺研究与相应的质量鉴定方法.
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物及其来源 清洁级昆明种雄性小鼠，由本校实验动物中心提供，符合卫生部《医学清洁级实验动物质量标准》.
1.1.2 试剂 CM Sepharose Fast Flow层析介质、等电聚焦标准蛋白为Pharmacia公司产品;抗鼠2.5S NGF单克隆抗体、2.5S鼠NGF标准品及West-ern blot试剂盒为Promega公司产品;200g・L-1 人血清白蛋白、200g・L
-1 甘露醇及其他化学试剂均为国产分析纯试剂，符合《中国生物制品主要原材料试行标准》（1993年版）规定.
1.1.3 主要仪器设备 XHF-1型高速分散器为上海金达生化仪器厂产品;LKB GP-10型液相色谱仪为Pharmacia公司产品;LGS-111型冷冻干燥机为上海长江制冷公司产品.
1.2 方法
1.2.1 鼠2.5S NGF的分离制取 参考Mobley等［8］ 的二次阳离子柱层析法从小鼠颌下腺中制取2.5S NGF.首先用CM I层析柱在pH近中性条件下吸附颌下腺匀浆上清中等电点大于6.8的杂蛋白并予以分离去除，收集穿过峰;然后在pH小于5的条件下使NGF解离为αNGF，βNGF以及γNGF亚基，利用βNGF与其他亚基等电点的差异，使用CM II层析柱吸附有生物活性的βNGF及其衍生物（共称为2.5S NGF组分），分段洗脱，收集2.5S NGF组分.
1.2.2 紫外吸收光谱及蛋白含量测定 用PEλ14型可见/紫外分光光度计对样品进行扫描，波长范围为200～320nm;Lowry法测定蛋白含量.
1.2.3 纯度及分子质量测定 SDS-PAGE电泳加薄层凝胶扫描测定样品纯度，120g・L-1 PAGE凝胶垂直平板电泳，电极液为pH8.3甘氨酸-Tris缓冲液，上样量5μg，电压120V，电泳1.5h，硝酸银染色;根据各标准蛋白移动的相对距离在半对数纸上绘制标准曲线，由样品蛋白的相对移动距离从标准曲线上查出相应分子质量.
1.2.4 鉴别试验及等电点测定 采用免疫印迹法（Western blot）鉴定NGF与特意抗体的结合力.薄层聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦法测定样品的等电点，70g・L-1 聚丙烯酰胺凝胶，厚1mm，含pH3.5～10两性电解质，上样样品量20～30μL，电泳条件为:电压1500V，功率1W・cm-1 宽凝胶.
1.2.5 生物活性测定 鸡胚背根神经节培养法［9］ 测定生物活性，取孵化7～10d的鸡胚背根神经节接种于涂布鼠胶原纤维的24孔培养板中，加入含不同浓度NGF的DMEM培养液，在无血清条件下37℃培养24～48h，倒置显微镜下进行相差观察，确定NGF提取物的生物活性，以突起生长最好的稀释度的倒数定为NGF生物活性单位（BU）.
1.2.6 冻干 用生理盐水配制的60g・L-1 甘露醇或20g・L-1 白蛋白将检定合格的半成品稀释至5×106 BU・L-1 ，0.22μm滤膜过滤除菌.使用2mL西林瓶，每支分装0.5mL，内含2.5S NGF2500BU，冻干得成品，置4℃以下干燥处保存.
2 结果
2.1 鼠龄与体质量对最终产量的影响 鼠龄低于60d，体质量少于20g的未成年小鼠，不仅最终NGF的产量明显低于成年雄性小鼠，而且其生物活性也明显低于标准，相反，使用体质量超过30g的种公鼠颌下腺，2.5S NGF的终产量更高（Tab1），制备量扩大至每次2000只成年雄鼠，获得了相似的结果.
2.2 紫外吸收光谱及蛋白质含量 2.5S NGF提取物呈典型的蛋白吸收曲线，最大吸收峰值为（280±1）nm;半成品蛋白含量大于0.15g・L-1 .
2.3 纯度及分子质量 在SDS-PAGE电泳中，纯化产物形成一条稍宽的带（Fig1），凝胶扫描纯度大于 95%，Mr 为13500.
表1 小鼠鼠龄和体质量对NGF产量与活性的影响 略
图1 略
2.4 鉴别试验与等电点 将2.5S NGF SDS-PAGE带转移到NC膜上，与NGF抗体进行结合反应，经免疫显色，NC膜上相应于2.5S NGF带处出现1条棕色带（Fig2）;等电聚焦电泳出现3条带，其pI值分别为8.7，9.0和9.2（Fig3）.
2.5 生物活性及比活性 采用中国药品生物制品检定所提供的2.5S NGF参比品为标准，经校正，我们实验中提取的各批样品生物活性一般大于5×107 BU・L-1 .根据计算，比活性不低于5×108 BU・g-1 蛋白.
图3 略
2.6 赋形剂和保护剂的选择 采用60g・L-1 甘露醇做赋形剂和保护剂，冻干后成形、色泽均良好，但其生物活性损失很大;使用20g・L-1 白蛋白，冻干后活性无损失，各种理化指标均符合标准，但成形稍差，结构略显疏松.
3 讨论
NGF主要来源于唾液腺如颌下腺、前列腺、蛇毒及脑内胆碱能神经元支配区，其中以成年雄性小鼠颌下腺含量最高.小鼠颌下腺NGF是7S NGF的高分子物，含有α，β，γ3个亚单位，具有生物活性的是同源β二聚体，每个单体含118个氨基酸，Mr 约13500，等电点约9.2.研究结果［10，11］ 显示人鼠间NGF基因编码的β亚单位氨基酸序列同源性高达89%，且哺乳动物NGF受体具有高度的保守性，表明不同物种间的NGF具有相同的生物学功能.因此我们选择成年雄性小鼠为研究对象，建立了从其颌下腺分离纯化βNGF的制备工艺及相应的质量检定标准.
βNGF肽链常发生两种修饰，一种发生在N端，水解失去含8个氨基酸残基的肽段，另一种发生在C端，水解失去一个精氨酸残基.这就衍生出NGF的多种形式，它们彼此之间存在着等电点、分子质量的微小差异.因沉降系数约为2.5，故被统称为2.5S NGF.因为上述修饰不涉及活性中心部位重要的氨基酸残基，所以各种形式仍具有βNGF的全部活 性［12，13］ .我们纯化的2.5S NGF在等电聚焦电泳中出现3条带，即为βNGF的不同修饰形式，其结果与文献［2］报道一致.在研制过程中，我们发现鼠龄和体质量对NGF的产量有较大的影响，鼠龄越大，NGF产量越高，生物活性也随之升高.这是由于NGF的产生是由雄激素刺激NGF在颌下腺粒曲导管细胞表达的结果，所以动物来源应是60d龄以上的成年雄性小鼠，未成熟鼠和雌鼠不宜选用.另外，我们观察了两种不同的赋形剂对冻干样品外观及生物活性的影响，NGF做为一种多肽类生物活性物质，在体外极易失活，20g・L-1 白蛋白对NGF活性的保护优于60g・L-1 甘露醇.
致 谢 本工作得到生物化学与分子生物学教研室王国华高级实验师、药立波教授等的大力支持与帮助.
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