关键词: 神经元;烟碱;受体，胆碱能;抗体;重症肌无力
摘 要:目的 用重症肌无力（MG）患者的乙酰胆碱受体抗体（AChRab）选择性地显示神经元烟碱型乙酰胆碱受体. 方法 用Elisa法测定MG患者血中的AChRab滴度，然后用硫酸铵盐析和免疫亲和层析法提取纯化AChRab，再用免疫组化法探讨AChRab与大鼠CNS神经元-nAChR之间的免疫结合反应. 结果 首次表明AChRab与神经-nAChR之间的阳性免疫结合反应广泛分布于鼠CNS许多部位，如大脑皮层、脑干各颅神经运动核团、脊髓运动神经元等部位，与用其他方法显示者其分布一致或类同. 结论 MG患者AChRab可与大鼠和猴CNS神经-nAChR交叉结合;可用于选择性地显示CNS神经-nAChR.
Keywords:neurons;nicotine;receptors，cholinergic;anti-bodies;myasthenia gravis
Abstract:AIM To study the method of expression of neu-ronal nicotinic acetylcholine receptor by acetylcholine receptor antibody purified from myasthenia gravis serum.METHODS ELISA assay was applied to detect the acetylcholine recep-tor antibody（AChRab）.AChRab was purified by im-munoaffinity tomography method and was used to study the immunoreaction between acetylcholine receptor antibody and rat central nervous system neuronal nicotinic acetylcholine re┐ceptor.RESULTS The positive immunoreaction between acetylcholine receptor antibody and central neuronal nicotinic acetylcholine receptor was widely distributed in rat central nervous system，for instance，cerebral cortex，brain stem motor necleus and spinal motor neurons.The distribution pattern was consistent with other methods.CONCLUSION AChRab from MG can crossreact with rat neuronal nicotinic acetylcholine receptor and can selectively express central neu-ronal nicotinic acetylcholine.
0 引言
既往多采用放射自显影、原位杂交和免疫组化法来，研究中枢胆碱能神经系统［1-3］ .乙酰胆碱酯酶组化和ChAT免疫组化法等不能特异性地显示神经-mAChR和神经-nAChR.目前用原位杂交和抗神经-nAChRα和β亚单位亚型单抗免疫组化法来研究CNS中神经-nAChR各亚型的分布及其与某些疾病发病机制之间的关系，但技术操作繁琐，不易广泛推广应用.
分析肌和神经-nAChR亚型基因组成和结构，发现两者均属于配体-门控-离子通道基因家族，两者的同源性达80%～90%［4］ .重症肌无力（MG）的AChRab可特异性地与肌-nAChRα-亚单位主要免疫区结合［5，6］ .因此，AChRab也有可能与CNS中的神经-nAChR免疫交叉结合，选择性地显示神经-nAChR.本项研究，先提取纯化AChRab，然后利用免疫组化法探讨AChRab与鼠CNS神经-nAChR之间的免疫结合反应，旨在建立一种简便易行的显示CNS神经-nAChR的方法.
1 材料和方法
1.1 提取和纯化 AChRab根据典型的MG症状，阳性的抗胆碱酯酶药物试验和血清中AChRab滴度测定结果诊断MG.利用Protein G（Sigma），从3例AChRab阳性的全身型MG患者血中提取纯化AChRab.3名健康者为正常对照.
1.2 免疫组化 选成年SD大鼠各20只，平均体质量250～300g.用戊巴比妥深度麻醉，左心插管，用40g L-1 的冷（4℃）多聚甲醛液400mL灌注固定20～30min;迅速取脑，入200g L-1 蔗糖溶液1d.取全脑续列冰冻切片，40μm厚，入3g L-1 TritonX-100，室温下30min，然后用KPBS（0.01mol L-1 ）洗3次，15min/次;然后分别用AChRab（KPBS1 100稀释）和从健康人血中提取的IgG，4℃下孵育48h，KPBS洗3次，15min/次;用生物素化羊抗人-IgG（武汉博士德公司）室温下孵育切片4h，KPBS洗3次，15min/次;最后用生物素-亲和素（Sigma）室温下孵育切片3h，KPBS洗3次，15min/次.用二甲基联苯铵-硫酸镍铵加强法呈色，适时终止反应.
2 结果
免疫组化结果显示，AChRab和神经元-nAChR之间的阳性免疫结合反应弥散地分布于鼠CNS许多部位.各部位神经元-nAChR样阳性免疫结合反应强弱有别，有些部位呈强阳性，而在另一些部位则呈中等或弱阳性反应，甚至无阳性反应.大脑皮层除分子层中无阳性反应外，第Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ及Ⅵ层中均有神经元-nAChR样阳性免疫结合反应，其中第V层大锥体细胞呈强阳性反应，并发出长长的突起伸向皮层表面，至第皮层Ⅱ和Ⅲ层，而第Ⅳ层阳性反应神经元相对稀少（Fig1A）;梨状皮层部分神经元也呈强阳性反应;海马皮层锥体细胞胞体呈较强阳性反应，突起阳性反应相对弱，而且海马不同区，如CA1，CA2及CA3区阳性反应强度不尽相同;丘脑各核团神经元呈中等阳性反应，而在丘脑网状核中却能看到边界清楚着色较深的强阳性反应神经元（Fig1B）;下丘脑室旁核、视上核（Fig1C）、中脑黑质致密部（Fig1D）、三叉神经中脑核（Fig1E）等均呈强阳性反应;脑干颅神经核团呈中-强阳性反应，如面神经核（Fig1F）;脑干网状结构巨细胞部神经元胞体及突起呈强阳性反应，可看到许多清晰的突起伸向邻近结构（Fig1G）;在小脑可看到轮廓清晰的浦肯野细胞胞体及伸向小脑皮层的突起，呈强阳性，而在颗粒层中却没有见到阳性免疫结合反应（Fig1H）. 图1 略
3 讨论
3.1 AChRab与肌和神经┐nAChR之间的免疫反应机制 肌-nAChR是由2α1，β2，，δ亚单位组成的五聚体.用肌-nAChRα-亚单位单抗，已从多种脊椎动物CNS中提取纯化了神经-nAChR样蛋白.用神经-nAChRα和β亚单位单抗研究发现，神经-nAChR亚单位α2，α3，α4，α5，α6，α7，α8和β2，β3，β4亚型广泛分布于脊椎动物CNS许多部位，如脊髓、脑干、下丘脑、丘脑、大脑皮层、海马、小脑等［7］ .本项研究首次表明，AChRab可与神经-nAChR免疫交叉结合，并发现与大鼠CNS神经-nAChR亚单位α3，α7，α8亚型分布相符［2，3］ .AChRab与神经-nAChR交叉结合的机制:①肌和神经-nAChR两者均属于配体-门控-离子通道基因家族;②人类的神经-nAChRα和β亚型与多种动物的神经-nAChR亚型肽链之间高度同源.如将人的α7亚型多肽链与大鼠的神经-nAChR比较，同源性高达80%～90%，而人的α3亚型与大鼠的α3亚型之间同源性高达93%［8，9］ .
现主要根据放射自显影、原位杂交和抗α，β亚单位单抗免疫组化法来研究CNS中神经-nAChR亚型的分布［1-3］ .神经-nAChR受体激动剂或拮抗剂，对由不同亚型组成的受体亲和力不同，放射自显影结果不同，由此推断CNS中神经-nAChR亚型的分布.上述方法有一定的局限性，仍不能准确地显示CNS中神经-nAChR亚型的分布.迄今为止发现的选择性高，且特异性强的配体数量有限，很难显示全部受体亚型.原位杂交只能显示胞核或胞质内的某一亚型mRNA.如在研究帕金森氏病与神经-nAChR之间的关系时发现，免疫组化结果证实患者CNS中神经-nAChR明显减少，但原位杂交却发现患者CNS中神经-nAChR亚型mRNA量并没有减少，提示患者CNS中神经-nAChR量的减少与受体亚型mRNA转录翻译过程有关［10］ .
3.2 研究首次表明AChRab可与CNS神经┐nAChR交叉结合 可利用此特性选择性地显示神经-nAChR;结果表明AChRab可与神经-nAChR中的一种或多种受体亚型结合，不同脑区免疫反应程度不同，提示AChRab与不同脑区的神经-nAChR亲和力不同.
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