【关键词】 ，下丘脑
关键词: 下丘脑;基因，Fos;神经胶质原纤维酸性蛋白;失重模拟
摘 要:目的 了解长期模拟失重状态下大鼠下丘脑功能活动状态. 方法 用Fos和胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）的ABC法，分别检测4周模拟失重大鼠下丘脑神经元和星形胶质细胞（AS）的变化. 结果 二者表达仅见于室旁核尤其大细胞部、视上核和视交叉上核，而其它部位未见表达;AS胞体变大、突起增粗增长. 结论 下丘脑这些核团参与了对长期失重的反应，且可能与加压素分泌增加有关.
Keywords:hypothalamus;gene，Fos;glial fibrillary acidic protein;weightlessness simulation
Abstract:AIM To research the functions of rat hypothala-mus under long-term simulated weightlessness condition.METHODS By using anti-Fos and anti-GFAP immunohis-tochemical ABC methods，we observed changes of hypothala-mus neurons and astrocytes in4wk simulated rats.RE┐SULTS Expressions of Fos-and GFAP-positive cells were only found in paravetricular nuclei of the hypothalamus，es-pecially in mango cellular part，supraoptic nuclei and suprachiasmatic nuclei，with negative reaction in other areas.The reactive astrocytes were featured with hypertrophy of
the cell body and cytoplasmic processes.CONCLUSION These nuclei in hypothalamus may participate in the reaction to long-term weightlessness，and probably be associated with increased secretion of vasopressure.
0 引言
下丘脑-垂体系统为调节机体机能的活跃区，航天引起的生理变化几乎都受神经内分泌的影响.失重是航天员无法消除的因素，失重后下丘脑-垂体系的变化直接或间接影响心血管系统、水盐代谢、骨质代谢及免疫和肌肉的适应性变化［1］ .有研究表明，PVN在失重后加压素（AVP）功能发生变化，AVP分泌增加，显示其对失重的反应［2，3］ .但长期失重后下丘脑功能活动是否有变化仍不清楚.
近年星形胶质细胞（AS）在神经系统中的作用已受重视，表现出多种结构和功能，与神经元间存在双向通讯，在神经系统功能活动中具有重要的作用［4，5］ .研究发现太空飞行14d大鼠海马内GFAP表达明显减少［6］ ，但下丘脑部位GFAP表达有否变化及与神经元间的关系未见报道.
我们拟利用功能形态学的方法，观察4wk模拟失重大鼠下丘脑内Fos和GFAP表达的变化，探讨下丘脑PVN和SON的神经元和AS是否参与对失重的反应，并探讨二者之间的关系.
1 材料和方法
1.1 实验组
1.1.1 动物模型制备 体质量160g左右的雄性Spraque-Dawley大鼠（本校实验动物中心提供）.按体质量配对原则随机分为悬吊组与同步对照组各6只.悬吊组尾部悬吊按文献［7］方法进行，动物在悬吊期间始终保持-30°头低位及后肢悬空不负重.2组分别单个饲养，每日摄入饲料成分与食量相当，饮水不限，室温保持在（23±2）℃，人工控制动物室内照明，每昼夜均保持12h光照与黑暗循环交替，室内保持安静.
1.1.2 切片制备 动物解除悬吊后立即在戊巴比妥钠（40mg kg-1 ，ip）深麻下开胸，经升主动脉插管，先以100mL生理盐水冲洗血液，继以含40g L-1 多聚甲醛的0.1mol L-1 磷酸缓冲液（pH7.4）500mL，灌流1.5h以上，注毕立即取脑置于200g L-1 蔗糖溶液中过夜（4℃），至组织块沉底.下丘脑部位作冰冻连续冠状切片，片厚30μm，置于10mmol L-1 的PBS中.
1.1.3 免疫组化反应（ABC法） 切片先入含3g L-1 Triton X-100的PBS浸泡30min（室温）.切片分为二组:第一组:抗Fos蛋白免疫组化反应（ABC法）:抗Fos蛋白免疫组化反应:①入兔抗Fos抗体稀释液（1 1000，Santa Cruz），孵育48h（4℃）;②生物素标记的羊抗兔IgG（1 500，Sigma），放置2h（室温）;③生物素-卵白素-HRP复合物（ABC，1 500，Sigma），放置2h（室温），最后用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍铵法呈色.以上每一步骤之后均用PBS液充分漂洗3次，每次10min（下同）.第二组:抗GFAP免疫组化反应:①入兔抗GFAP抗体稀释液（1 3000，Sigma），孵育48h（4℃）;②生物素标记的羊抗兔IgG（1 500），孵育2h（室温）;③生物素-卵白素-HRP复合物（ABC，1 500），孵育2h（室温），最后用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍铵法呈色.
切片漂洗后裱片、晾干、脱水、透明和封固，光镜下观察并摄像.
1.2 对照组
1.2.1 空白对照组（n=2） 将上述环境下饲养的同步对照大鼠按上述方法麻醉灌注取材切片，作抗Fos和抗GFAP免疫组化反应，以观察动物在基础状态下中枢神经系统内Fos和GFAP表达情况.
1.2.2 免疫组化染色替代实验 取实验组大鼠部分延髓切片，用10mmol L-1 PBS分别取代抗Fos和抗GFAP抗体，再按ABC法进行免疫组化染色，结果为阴性.
2 结果
2.1 对照组
2.1.1 Fos阳性神经元 其胞核为黑色，胞质为阴性，在PVN，SON和SCh有少量分布（Fig1-A’，B’）.
2.1.2 GFAP阳性细胞 上述核团GFAP阳性细胞表达较少（Fig2-A’，B’）.这些细胞的形态特点是胞体小，突起细而短.
2.2 实验组
2.2.1 Fos阳性神经元 集中在PVN的大小细胞 部（Fig1-A），尤其以腹侧大细胞部更明显（Fig1-A1），SON（Fig1-B）和视交叉上核（SCh）均有大量表达.
2.2.2 GFAP阳性细胞 主要特点是:①与对照组比较，GFAP阳性细胞胞体变大，突起变粗变长，形成一种肥大型的AS;②在上述Fos表达阳性部位的GFAP表达数量均见明显增加（Fig2-A，B），表现出二者部位和范围的一致性.
3 讨论
3.1 模拟失重的动物模型 尾部悬吊模型是由NASA提出的，近十年被广泛应用，较其他方法显示出其优越性，它既能模拟失重时的低运动负荷，又能模拟血液动力学的低动力状态，陈杰等［7］ 对该方法进行了改进，研究结果表明该种方法可悬吊120d，期间对大鼠的应激影响轻微，且出现血液向头部流动、血容量减少、后肢肌肉萎缩、骨机械性能变差等和其他一些生理性改变，类似于航天员失重引起的一些典型变化.
3.2 Fos蛋白和GFAP表达的意义
3.2.1 机体在失重状态下出现多种生理性变化 除了各部承受载荷削减外，还出现体液及血液头向转移和重新分配，进而导致血量减少以及心血管系统适应低负荷状态的一系列调整变化将伴随失重状态的始终，这必然导致参与此状态下心血管调节的相应中枢部位神经元一直处于激活状态，用Fos表达可以显示出来.4wk模拟失重大鼠中枢内可观察到多个部位出现Fos表达，在下丘脑主要为PVN，SON和SCh等，说明这些部位参与了对失重的反应. PVN的大细胞部主要分泌加压素，而小细胞部则与心血管调节中枢几个重要的区域互相投射，包括PBN，MVZ各部及脊髓侧角交感节前神经元，本实验发现PVN大小细胞部、包括腹侧大细胞部出现大量的Fos表达，这在出血或药物诱发的急性血压改变时未见到，结合SON阳性神经元亦较多，提示失重状态下下丘脑一方面通过与其他心血管中枢联系尤其是与延髓间的神经调节通路，一方面通过释放加压素的神经内分泌 体液调节通路，共同完成心血管功能调节以适应失重带来的变化，包括血液头向流动、全身低血容量等，这一结果与失重状态下加压素分泌增加是一致的［2，3］ .
3.2.2 Fos和GFAP表达部位基本一致 GFAP被认为是星形胶质细胞活化状态的标志之一，已广泛应用于生理刺激或病理状态的研究中［8，9］ .我们在同一切片上同时观察神经元和AS的变化未见报道，它反应了兴奋性神经元和兴奋性AS的相互关系.本研究显示，4wk模拟失重大鼠GFAP阳性表达细胞同Fos阳性神经元一样，在上述部位集中分布，明显多于对照组，表现为细胞增多，胞体变大，突起增粗增长，表明AS对模拟失重刺激起反应并表现出活化状态，显示出机能、部位的特异性.本研究显示GFAP表达的部位与Fos蛋白表达的部位一致，提示AS可能参与中枢对失重状态下心血管功能的调控过程.从以上可以看出GFAP与神经元活动无论从部位上还是时间上都相吻合，二者在对模拟失重过程中以某种内在的协同或制约机制，共同完成对模拟失重的神经调节.
图1 － 图2 略
3.3 下丘脑Fos表达的机制 既往研究证实，A1，A2区的去甲肾上腺素能神经元是延髓心血管中枢的重要组成部分，参与压力反射对血压的调控［10］ ，来自外周主动脉压力感受器的心血管冲动经NTS和VLM中继后上传到PVN，调控其分泌机能［11］ .Li YW等证实外周血压改变可诱发PVN和SON大量Fos表达，且大部分为加压素能神经元，提示血压改变可激活PVN加压素神经元［12］ ，进而改变加压素的释放.研究表明失重状态下A2的去甲肾上腺素转运速度降低，说明NTS（包括A2）细胞群卷入了压力反射，由于心血管传入冲动发生改变，促使其调控中枢发生适应性改变［2］ .我们的研究结果亦提示，延髓内脏带内神经元参与模拟失重状态下心血管调控，且部分为儿茶酚胺能［13］ ，可以推测失重状态下的低血容量变化，血液在头部分布增加，头颈部血管跨壁压力加大［14］ ，压力感受器不断接受刺激并上传，一方面通过压力感受器反射通路影响交感神经输出;一方面经NTS，VLM上传给PVN，影响AVP合成和释放;同时PVN内Fos阳性神经元亦可能通过向延髓内脏带投射，调节压力反射传入［15］ ，或通过PVN直接投射到脊髓交感节前神经元，影响交感输出.
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