作者：范雄林 徐志凯 李元 薛莹 张芳琳 李别虎 白光春
【关键词】 分枝杆菌
关键词: 分枝杆菌，结核;疫苗，DNA;基因;免疫性;免疫原性;Ag85B
摘 要:目的 研究已构建的编码结核分枝杆菌（Mycobac-terium tuberculosis，MTB）H37Ra株Ag85B成熟蛋白基因的真核表达质粒pTB30m的表达和免疫原性. 方法 以电穿孔法将pTB30m转染CHO细胞，RT-PCR法检测转染细胞中Ag85B特异的mRNA的表达.将pTB30m质粒肌注免疫BALB/c和C57BL/6小鼠，ELISA法检测基因免疫的体液免疫应答效果.分离免疫小鼠的脾淋巴细胞，体外用抗原再刺激，生物学方法检测IFNγ 产生水平和MTT法检测淋巴细胞增殖. 结果 RT-PCR检测证实pTB30m可在CHO细胞中表达.pTB30m免疫小鼠可引起较高水平的Ag85B特异性的抗体应答.免疫小鼠的脾淋巴细胞，体外用抗原再刺激，淋巴细胞增殖显著，BALB/c和C57BL/6小鼠IFNγ 的量分别达到1360ng L-1 和1965ng L-1 ，而生理盐水和空质粒对照组均低于80ng L-1 . 结论 应进一步研究pTB30m作为TB的基因疫苗用于TB的防治的效果.
Keywords:Mycobacterium tuberculosis;vaccines，DNA;genes;immunity;immunogenicity;Ag85B
Abstract:AIM To investigate the expression and immuno-genicity of recombinant eukaryotic expression plasmid pTB30m encoding mature form of Ag85B of Mycobacterium tuberculosis H37Ra strain.METHODS pTB30m was trans-fected into CHO cells by electroporation，and expression was analyzed by RT-PCR at the level of mRNA.After BALB/c and C57BL/6mice were vaccinated by pTB30m，ELISA was used to detect the antibody titer of immunized mice sera.Level of IFNγ secreted by splenocytes of immunized mice up-on antigen-specific stimulation was detected by using a cyto-pathic effect reduction assay and splenocytes proliferation of immunized mice in response to antigen restimulation was measured by MTT method.RESULTS pTB30m induced higher titer specific antibody against Ag85B in immunized mice and protective cell-mediated immunity，characterized by splenocytes which upon antigen-specific stimulation secreted increased levels of IFNγ and proliferated significantly.CON┐CLUSION pTB30m should be further tested as DNA vac-cine of TB in preclinical animal models.
0 引言
结核病（tuberculosis，TB）是长期危害人类健康的严重疾病之一.尤其是近年来耐药结核分枝杆菌（DRMTB）的流行，以及MTB和HIV双重感染，导致TB的发病率和死亡率大幅度上升.目前，TB已成为传染病中的头号杀手.BCG接种是预防TB的重要措施，但其预防效果不稳定.寻求新的TB防治措施是当务之急.MTB基因疫苗的研究可能是解决此问题的方法之一，并已成为当前国内外研究的热点.我们已构建了编码MTB Ag85B成熟蛋白基因的真核表达载体［1］ .在此，我们进一步研究了该重组载体在体外的表达和在小鼠体内诱生体液免疫和细胞免疫应答的能力.
1 材料和方法
1.1 材料 pTB30m质粒是编码MTB Ag85B成熟蛋白基因的真核表达质粒，由作者构建［1］ .pcDNA3质粒、E.coli JM109宿主菌和CHO细胞系由本室保存.MTB H37Rv株由陕西省结核病防治研究所王瑞副主任技师惠赠.RPMI1640，DMEM，HEPES和SuperscriptTM II逆转录试剂盒购自GIBCO公司.Taq DNA聚合酶、dNTPs和PolyATtract○R System1000购自Promega公司.Nucleotrap小量DNA纯化试剂盒购自Clontech公司.PEG8000购自原平皓公司.新生牛血清、BglⅡ，羊抗鼠IgG-HRP为华美公司产品.P1，P2引物由西安美联公司合成［1］ .大肠杆菌重组表达的Ag85B标准品由加州大学Harth G.博士赠送.布吡卡因是上海天丰制药厂产品.IFNγ 标准品购自晶美公司（PeproTechEC产品，England），MTT购自Sigma公司.电穿孔仪是BIO-RAD Gene PulserⅡ.BALB/c和C57BL/6雌性小鼠，6～8wk龄，由本校实验动物中心提供，饲养于校动物中心P3实验室.
1.2 方法
1.2.1 质粒的提取和纯化 将质粒pTB30m和pcDNA3分别转化E.coli JM109宿主菌，经酶切鉴定筛选阳性克隆.将阳性克隆分别接种于5mL LB液体培养基（含Amp100mg L-1 ），37℃振荡培养过夜.次日按1 100的比例扩大培养.质粒的大量提取按常规方法进行，采用PEG法纯化［2］ .紫外分光光度计定量，用无菌生理盐水稀释成浓度为1.25g L-1 .细胞转染用的质粒进一步用BglII消化，10g L-1 琼脂糖凝胶电泳分离，Nucleotrap DNA试剂盒回收纯化，操作按说明书进行.
1.2.2 转染CHO细胞 将CHO细胞常规培养于含150mL L-1 FCS，10g L-1 HEPES，10g L-1 谷氨酰胺的DMEM中.收集对数生长期的CHO细胞，重悬于800μL的HEBES低压电穿孔液（10mmol L-1 HEPES，68.5mmol L-1 NaCl，2.5mmol L-1 KCl，0.35mmol L-1 Na2 HPO4 ，3mmol L-1 Dextrose，pH7.3）中，细胞数约为5×106 .取纯水溶解的线性质粒pTB30m和pcDNA3各30μg，分别与上述细胞悬液于0.4cm直径的穿孔杯中混匀，冰浴10min后，低压电穿孔转染CHO细胞，电穿孔参数为电压230V，电容950μF.电穿后，冰浴10min，将细胞转入6孔培养板，加上述DMEM培养液培养，次日换液.48h后，弃去培养液，胰酶消化收集细胞.同时设正常细胞为阴性对照组.
1.2.3 RT-PCR检测Ag85B成熟蛋白mRNA的表达 将收集的质粒转染的CHO细胞用PBS清洗一次后，参照说明书用PolyATtract○R System1000提取细胞的mRNA，溶于DEPC处理的ddh3 O10μL中.cDNA第一链的合成参照说明书进行.PCR反应条件是:在50μL的反应体系中，cDNA第一链2μL， 10×PCR Buffer5μL，10mM dNTPs2μL，Taq DNA聚合酶1μL（5U），P1，P2引物各1μL，加ddh3 O至50μL.循环参数参见文献［1］.结果用10g L-1 琼脂糖凝胶电泳鉴定.
1.2.4 基因免疫 小鼠后大腿每侧各im7.5mL L-1 布比卡因和质粒混合物（1 4）50μL，每次每只共计100μg质粒.每隔2wk在相同部位注射相同剂量，共免疫3次.同时设灭菌生理盐水阴性对照和质粒pcDNA3空白对照，按同样方式进行免疫.
1.2.5 血清Ag85B抗体的测定 基因免疫接种完成后第4wk剪尾取血，分离血清，用ELISA的方法测定血清中Ag85B抗体的滴度.每孔用50μL的MTB培养滤液蛋白（CFP，由本室制备，溶于PBS，25g L-1 ）或标准品（5mg L
-1 ）包被酶联板，4℃过夜.10g L-1 BSA37℃封闭30min，洗涤后加不同稀释度的待检血清，二抗为羊抗鼠IgG-HRP，OPD底物显色后，测波长490nm光吸收值.以正常鼠血清作阴性对照，光吸收值0.05以上，P/N≥2.1为阳性.
1.2.6 抗原特异的脾淋巴细胞增殖实验 分别分离各组小鼠的脾淋巴细胞，调整细胞数为5×108 L-1 ，每孔200μL，在96孔板用含100mL L-1 FCS的RP-MI1640完全培养液中培养，同时每孔加入CFP50μL为实验组，对照组不加CFP，调零孔不加脾细胞，37℃50mL L-1 CO2 孵箱培养68h后，每孔加入20μL MTT（5g L-1 ，溶于PBS，pH7.2），继续培养4h后终止培养，去尽上清，每孔加入DMSO150μL，振荡10min，测A490nm值.结果用刺激指数（stim-ulation index，SI）SI=A实验组 /A对照组 表示.
1.2.7 IFNγ 的诱生和测定 5×109 L-1 脾细胞在96孔板用含100mL L-1 FCS的RPMI1640完全培养液中培养，每孔200μL，同时每孔加入CFP50μL，37℃50mL L-1 CO2 孵箱培养72h后，每组3个孔中的培养液混合，5000r min-1 离心5min，取上清，-20℃冻存备检.IFNγ 含量的检测用生物学的方法.L929细胞用含50mL L-1 FCS的RPMI1640完全培养液在96孔板培养，每孔约3×104 细胞，各加不同稀释度的待检样品和IFNγ 标准品，37℃50mL L-1 CO2 培养箱培养24h，再加50μL100TCID50 VSV攻击20h，每孔加入20μL MTT，继续培养4h后终止培养，同上检测A490nm值.以标准IFNγ 为准根据直线作图法计算待检IFNγ 含量（1U相当于100pg）.
2 结果
2.1 Ag85B成熟蛋白mRNA的表达 采用电穿孔法，将重组载体pTB30m电转移到CHO细胞中，同时以pcDNA3转染CHO细胞作空白对照和正常CHO细胞作阴性对照，48h后，提取转染细胞的RNA进行RT-PCR反应.结果表明，重组载体的CHO细胞中扩增出1条880bp的目的条带，而对照组缺如（Fig1）.
图1 略
2.2 血清Ag85B抗体的水平 用ELISA的方法对基因免疫后的各组小鼠血清中抗Ag85B抗体的水平进行了测定.质粒空白对照组和生理盐水阴性对照组的鼠血清Ag85B抗体全部为阴性，pTB30m质粒免疫鼠血清Ag85B抗体全部为阳性，BALB/c和C57BL/6小鼠产生的抗体滴度在个体小鼠间略有差异，滴度变化从1 20到1 100不等，其几何平均滴度分别为1 60和1 80.
2.4 IFNγ 的水平 表达质粒pTB30m免疫小鼠后的脾细胞用MTB CFP刺激，悬液中IFNγ 的水平用生物学的方法检测，BALB/c和C57BL/6小鼠IFNγ 的量分别达到1360ng L-1 和1965ng L-1 ，而空质粒免疫组和空白组分别低于80ng L-1 .
3 讨论
鉴于当前TB流行的严重程度和BCG预防TB的缺陷，国内外学者已转向MTB亚单位疫苗、减毒 活疫苗与基因工程重组活疫苗等的开发研究，以用于TB的防治.基因疫苗由于制备简单，可诱导持久的体液和细胞免疫应答，特别是可刺激产生CD8+ CTL反应［3］ ，这正是防治TB所需的保护性免疫反应，因而MTB基因疫苗的研究既是TB疫苗研究的优先领域又是当前国内外研究的热点.
图2 略
国外已有MTB Ag85复合体、ESAT6和Hsp65等的基因疫苗研究的报道.Ag85B作为亚单位疫苗与多个蛋白的比较［4］ 或用作基因疫苗比较［5］ ，均表明它是MTB较好的保护性靶抗原之一.我们采用已构建于真核表达载体pcDNA3上的编码Ag85B成熟蛋白的重组质粒pTB30m，通过在体外转染CHO细胞，RT-PCR法检测证实了相应蛋白的mRNA的表达;用pTB30m免疫BALB/c和C57BL/6小鼠后，均可诱发较高水平的特异性的抗体产生.不同种系的小鼠产生抗体的水平有差异，与国外的报道一致［6］ .个体小鼠产生抗体的水平有差异可能与小鼠个体差异和免疫接种有关.机体抗结核的保护性免疫，主要依赖于Th1型的细胞免疫应答，即:①MHC-Ⅱ类分子介导的CD4+ Th1型细胞分泌IFNγ ，进而高度活化巨噬细胞杀灭吞噬的细菌;②MHC-Ⅰ类分子介导的CD8+ CTL的保护作用.我们的研究表明Ag85B基因免疫小鼠可诱发较高水平的IFNγ 的产生和脾淋巴细胞显著增殖为特征的细胞免疫反应.尽管我们未检测CD8+ CTL的作用，但Ag85B基因免疫小鼠的T细胞过继免疫给正常小鼠后，对MTB毒株的感染有一定的保护性（作者另文发表），仍有理由认为Ag85B基因免疫诱发的保护性是抗原激活的T细胞起着关键作用.
MTB基因疫苗是诱发体液免疫反应和保护性细胞免疫的有效措施.结合MTB的全基因组测序结果［7］ ，该方法在鉴定包含多达800种蛋白质的MTB CFP［8］ 中的保护性抗原具有重要意义.因此，我们已建立的研究模型用于快速筛检保护性抗原、以及研究新型TB疫苗都将非常有用.
致 谢 美国加洲大学Harth G.博士赠送大肠杆菌重组表达的Ag85B标准品;陕西省结核病防治研究所王瑞副主任技师、西京医院骨科刘松波博士、病理教研室郭爱林博士和本室黄庆生、阎岩、尹文和杨乔欣博士提供部分材料和试剂;特此致谢!
参考文献
［1］Fan XL，Xu ZK，Bai GC，Li Y，Li BH，Xue Y.Cloning of Ag85B of Mycobacterium tuberculosis and it’s construction of eu-karyotic expression vector ［J］.Xibao yu Fenzi MianyixueZazhi（J Cell Mol Immunol），2000;16（4）:314-316.
［2］Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.Molecular cloning:A lab-oratory manual ［M］.2nd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989:133-148.
［3］Tighe H，Corr M，Roman M，Raz E.Gene vaccination:Plasmid DNA is more than just a blueprint ［review］［J］.Immunol to-day，1998;19（2）:89-97.
［4］Sinha RK，Verma I，Khuller Gk.Immunobiological properties of a30kDa secretory protein of Mycobacterium tuberculosis H37Ra ［J］.Vaccine，1997;15（6/7）:689-699.
［5］Kamath AT，Feng CG，Macdonald M，Briscoe H，Britton WJ.Differential protective efficacy of DNA vaccines expressing se-creted proteins of Mycobacterium tuberculosis ［J］.Infect Im-munol，1999;67（4）:1702-1707.
［6］Ulmer JB，Liu MA，Montgomery DL，Yawman AM，Deck RP，DeWitt CM，Content J，Huygen K.Expression and immuno-genicity of Mycobacterium tuberculosis antigen85by DNA vacci-nation ［J］.Vaccine，1997;15（8）:792-794.
［7］Cole ST，Brosch R，Parkhill J，Garnier T;Churcher C;Harris D;Gordon SV;Eiglmeier K;Gas S;Barry-CE3rd;Tekaia F;Badcock K;Basham D;Brown D;Chillingworth T;Connor R;Davies R;Devlin K;Feltwell T;Gentles S;Hamlin N;Hol-royd S;Hornsby T;Jagels K;Barrell BG.Deciphering the biol-ogy of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome se-quence ［J］.Nature，1998;393:537-544.
［8］Jungblut PR，Schaible UE，Mollenkopf HJ，ZimnyArndt U，Raupach B，Mattow J，Halada P，Lamer S，Hagens K，Kauf-mann SH.Comparative proteome analysis of Mycobacterium tu-berculosis and Mycobacterium bovis BCG strains:Towards func-tional genomics of microbial pathogens ［J］.Mol Microbiol，1999;33（6）:1103-1117.