作者：胡丹 惠延年 Philip P.Chen
【关键词】 丝裂霉素C
关键词: 丝裂霉素C;人结膜囊成纤维细胞;细胞增殖;细胞培养
摘 要:目的 观察丝裂霉素C（MMC）对培养人结膜囊成纤维细胞生长及增殖的作用. 方法 用MTT比色法、
3 H-TdR掺入法及流式细胞仪检测细胞增殖周期观察MMC对培养的人结膜囊成纤维细胞生长及增殖的影响. 结果 0.4g・L-1 MMC作用5min后，可使成纤维细胞MTT比色A570nm 值7d内无显著变化（P&>0.05），3 H-TdR掺入实验CPM第1日较对照组降低了72.5%，至第7日时仍低于对照组86.2%（P&<0.01）.细胞增殖周期中，MMC组S期细胞的百分比明显低于对照组. 结论 临床使用剂量MMC可使结膜囊成纤维细胞增殖能力下降，处于增殖抑制状态，而不引起明显的细胞死亡.
Keywords:mitomycin C;human Tenon’s capsule fibroblast;cell proliferation;cell culture
Abstract:AIM To investigate the effects of mitomycin C（MMC）on the growth and proliferation in human Tenon’s capsule fibroblast.METHODS The cultured human Tenon’s fibroblasts were exposed to MMC.Cell growth and proliferation were measured by MTT assay，and3 H-thymi-dine（3 H-TdR）incorporation and cell cycle was examined by flow cytometry.RESULTS After the fibroblests were ex-posed to MMC（0.4mg・mL-1 ）for5minutes，the optic density obtained by MTT assay showed no significant sign of change within7days.The inhibition rate of the cell prolifera-tion was72.2%in the lst day and86.2%in the7th day shown by3 H-TdR incorparation.In the cycle analysis the percentage of S phase was much lower than the control.CONCLUSION MMC at clinically relevant doses can inhibit the proliferation of human Tenon’s fibroblasts rather than cause the cell death.
0 引言
滤过道处结膜下的瘢痕化是青光眼滤过手术后眼压不能控制导致手术失败的最主要原因［1］ ，手术中局部给予丝裂霉素C（MMC）已广泛地应用于临床.此方法被证明可以明显提高滤过手术的成功率并可维持较长时间，但MMC在此使用方法下的抗瘢痕形成的确切机制仍并不十分清楚［2，3］ .我们观察了MMC对人结膜囊成纤维细胞生长及增殖的影响，报告如下.
1 材料和方法
1.1 材料 MMC为日本Kyowa Hakko Kogyo公司产品，DMEM，四氮唑盐（MTT）均为美国Sigma公司产品，小牛血清、胰蛋白酶/EDTA为美国Gibco公司产品，3 H-TdR为中国原子能研究所产品.
1.2 方法 ①人结膜囊成纤维细胞的培养:人结膜囊组织取自美国华盛顿大学医学院眼科及本院眼科白内障手术患者，年龄50～70岁，白种人3例，黄种人2例.供体间未观察到明显差异（另文报告），结果一并处理.所有供者以往均无眼部手术史，近3mo来局部未使用抗青光眼药物及其他药物.培养后选第3～6代细胞用于实验.②MMC处理:将已铺满的成纤维细胞（96孔板）每孔加入0.4g・L-1 MMC100μL，5min后，DMEM洗涤3次，加入含20mL・L-1 小牛血清的DMEM，继续培养.③MTT比色实验:MMC处理后1，3，5和7d，每孔加入5g・L-1 MTT20μL，继续培养4h后，弃去培养液，加入DMSO150μL/孔.微型振荡器上振荡15min，在570nm波长测定吸光度（A），对照组DEME替换MMC，余步骤相同，每组设4个复孔，实验重复3次.细胞生长抑制率=（1-实验组A570nm /对照组A
570nm ）×100.④3 H-TdR掺入实验:MMC处理及分组同MTT比色实验，每孔加入18.5kBq3 H-TdR，继续培养12h，收集细胞于F4玻璃纤维滤纸.自动液闪计数仪测定样品的放射性cpm值，每组设4个复孔.实验重复5次.细胞增殖抑制率=（1-实验组cpm值/对照组cpm值）×100.⑤流式细胞仪测定细胞增殖周期:经MMC处理后的成纤维细胞，用不含血清的DMEM继续培养24h，消化、离心、固定后，调整细胞浓度为（5～10）×108 ・L-1 ，加入PI300μL染色30min，350目筛网过滤，流式细胞仪上测定细胞周期.
2 结果
2.1 MTT比色实验 与对照组相比，MMC组1d的生长抑制率仅为33.1%，但7d时已为80.3%，MCC组4时间点间A
570nm 无明显差异（P&>0.05，Tab1）.
表1 MMC作用5min对成纤维细胞生长的影响 略
2.2 3 H┐TdR掺入实验 MMC组1d增殖抑制率即达到72.5%，7d为86.2%，MMC组各时间点cpm值与对照组间均有显著差异（P&<0.01，Tab2）.
表2 MMC作用5min对成纤维细胞增殖的影响 略
2.3 流式细胞仪测定结果 MMC处理组G1 期较 对照组增加，而S期及G期则减小.处于G1 ，S和G2 期的细胞百分比，在对照组分别为87.5%，4.6%和7.9%;而MMC处理组分别为94.9%，1.9%和3.2%.
成纤维细胞是组织修复过程中最主要的细胞成分之一，局部成纤维细胞的数量及增殖程度是控制滤过道处结膜下过度纤维化从而影响青光眼滤过手术效果的重要因素［4］ .MMC因其有效的抗细胞增殖作用及对局部副作用较小而被广泛用于青光眼滤过手术中.目前为较多临床医生接受的方法为高浓度（0.2～0.4g・L-1 ），短暂作用时间（5min），手术中局部应用［2，5-7］ ，但此方法对局部成纤维细胞的作用仍并不完全明了并有不同的实验报道.
MTT比色试验是一种检测细胞存活的方法.在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比，故此法只能间接反映活细胞的数量，但不能测定DNA合成程度等反映细胞增殖能力的指标.而3 H-TdR掺入法则可反映DNA合成及代谢的状况，故其可较为准确地反映细胞增殖的情况而不仅仅是存活状态.本实验中，我们用0.4g・L
-1 MMC对结膜囊的成纤维细胞作用5min后，MTT法检测A570nm ，24h后仅较对照组下降了33.0%，从光镜下观察也可见大部分细胞仍保持正常成纤维细胞形态，但直至处理后7d，处理组活细胞数保持稳定，而对照组则增加了374.3%，同时，用3 H-TdR掺入试验24h处理组细胞的掺入率较对照组下降了72.5%，处理组的cpm值仍较对照组降低了86.2%，从细胞周期的改变可看出，MMC抑制了成纤维细胞从G1 期向S期及以后各期的转化，从而起到抑制成纤维细胞增殖的作用.
因此，本实验结果表明，MMC在青光眼滤过手术中的应用可使手术后结膜下受刺激的成纤维细胞的增殖能力受到抑制，并未象抗肿瘤细胞应用时那样主要依赖其细胞毒作用，而是抑制了成纤维细胞向增殖表型的转化，使局部的成纤维细胞数目，特别是具有增殖活力的成纤维细胞的数目相对减少，从而达到术后抑制结膜下细胞增生的作用.
参考文献
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