【关键词】 色素上皮细胞
关键词: 色素上皮细胞;视网膜;原位杂交;炎前因子;mRNA
摘 要:目的 观察视网膜色素上皮细胞（RPE）在炎性介质刺激下炎前因子mRNA的表达. 方法 培养的人RPE经IL-1β（10μg・L-1 ）和脂多糖（1mg・L-1 ）的刺激后，用生物素标记的寡核苷酸探针进行原位杂交，检测RPE炎前因子IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-αmRNA表达.杂交结果使用图像分析法进行比较. 结果 原位杂交显示RPE细胞质中均呈现浓淡不一的淡蓝色着色，胞核不着色.其中IL-6mRNA在脂多糖刺激下染色较浅，增加脂多糖的剂量不能提高其表达.图像分析显示在IL-1β（10μg・L-1 ）和脂多糖（1mg・L-1 ）刺激下，RPE表达IL-6mRNA的吸光度分别为108±18和35±14，二者之间有显著性差异（P&<0.01）. 结论 在IL-1β和脂多糖刺激下，人RPE可以表达炎前因子IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-α的mRNA.
Keywords:retinal pigment epithelium;retina;in situ hy-bridization;proinflammatory factors;mRNA
Abstract:AIM To determine whether retinal pigment epi-thelium（RPE）expresses proinflammatory factors messenger RNA（mRNA）in cultured RPE cells stimulated by inflam-matory factors.METHODS Cultured RPE treated with IL-1β（10μg・L-1 ）and lipolysaccharide（1mg・L-1 ）was used as models.The presence of mRNA coding for IL-1β，IL-6，IL-8and TNFαwas investigated by in situ hybridiza-tion（ISH）with biotin labeled oligonucleotide probes.Image analysis was performed to determine staining differences be-tween groups.RESULTS IL-1β，IL-6，IL-8and TNF-αmRNA positive cells showed light to dark blue staining in RPE cytoplasm after being stimulated with IL-1βand LPS.But IL-6mRNA showed light staining when RPE was treated with LPS，and greater dosage of lipolysaccharide（LPS）failed to enhance RPE mRNA expression.Image analysis showed that the optical densities of IL-6mRNA expression were108±18and35±14when RPE was respectively stimu-lated with IL-1βand LPS.The optical density value was sig-nificantly different（P&<0.01）.CONCLUSION The pres-ence of mRNA encoding for IL-1β，IL-6，IL-8and TNF-αis effectively detected by ISH in cultured human RPE stimulated with inflammatory factors.
0 引言
增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreo retinopathy，PVR）是常见的致盲性眼病之一，其发病的分子机制是目前眼底病研究的热点［1-3］ .临床研究发现许多炎前因子mRNA和蛋白质在PVR膜中不同程度的表达，与PVR的发生明显相关，其中IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-α在玻璃体切割液和PVR膜中水平较高［4-8］ .视网膜色素上皮细胞（reti-nal pigment epithelium，RPE）是PVR膜中的主要细胞成分，RPE细胞移行、增殖和分泌胶原在PVR形成中可能起重要的作用［1-8］ .我们用原位杂交法观察培养RPE在炎性介质作用下炎前因子IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-αmRNA的表达，以明确RPE是否表达炎前因子的mRNA，从而进一步了解PVR发生的分子机制.
1 材料和方法
1.1 材料 第3代RPE细胞由王雨生副教授惠增，培养条件为37℃，50mL・L-1 CO2 ，用含100mL・L-1 血清的DMEM培养.对近融合期细胞以2.5g・L-1 胰蛋白酶消化进行传代.选6～8代细胞用于实验.细胞培养主要试剂有:DMEM培养基（Gibco产品）、胰蛋白酶（Sigma产品）和小牛血清（杭州四季青产品）.将18mm×18mm的盖玻片分成4小块，高温高压消毒后多聚赖氨酸包被.无菌玻片平铺于直径10cm的培养皿中，将200μL密度为4×104 mL
-1 RPE悬液滴于的盖玻片中央，培养4h后补足培养液.细胞将近铺满时捞出玻片.终止培养前6h加入脂多糖（lipolysaccharride，LPS）1mg・L-1 ，或者IL-1β10μg・L-1 .切片用PBS漂洗3次，40g・L-1 多聚甲醛固定1～2h干燥后-20℃保存.
1.2 方法
1.2.1 培养细胞的鉴定 取细胞铺片采用SABC法，进行抗人角蛋白免疫组织化学染色.鼠抗人细胞角蛋白单抗系Dako产品;SABC试剂盒为博士德生物工程公司产品.
1.2.2 杂交探针 生物素标记IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-α寡核苷酸探针产自上海基康生物技术公司，探针序列分别为IL-1β:5’-TCA TCC TCA TTG CCA CTG TAA TAA GCC ATC-3’;IL-6:5’-CTC ACT ACT CTC AAA TCT GTT CTG GAG GTA-3’;IL-8:5’-GTT GGC GCA GTG TGG TCC ACT CTC AAT CAC-3’;TNF-α:5’-GCT GGG CTC CGT GTC TCA AGG AAG TCT GGA-3’［8-10］ .3’Biotin标记.原位杂交试剂盒由迈新公司提供.
1.2.3 原位杂交步骤 将细胞铺片放置于经洁净处理的载玻片上，2～3滴新鲜稀释的蛋白酶K，完全覆盖玻片边缘以保证充分消化蛋白质，37℃，10min.PBS漂洗3min×3次.37℃，5min孵育干燥.探针95℃，5min变性.置1滴探针于切片，盖玻片封盖.70℃，10min变性mRNA二级结构.湿房孵育37℃，3～4h使探针与目标基因结合.37℃清洗液洗玻片直至盖玻片脱落.滴1～2滴RNA酶A，37℃湿房孵育30min.蛋白阻滞剂37℃，3min×3次.加1～2滴鼠抗生物素，37℃湿房孵育40min.加1～2滴生物素化羊抗鼠，37℃孵育20min.清洗剂漂洗5min.加1～2滴碱性磷酸酶-链霉蛋白结合物，湿房孵育20min.加1～2滴底物室温孵育10min，直至完全显色.通过显微镜观察颜色的出现，阳性地方出现蓝色.蒸馏水漂洗2～3次.过乙醇和二甲苯，树胶封片. 统计学处理:染色结果进行图像分析，方法是每组取4张切片，每张切片选15个细胞测定细胞质中的吸光度，以x ±s表示，用t检验进行比较.
2 结果
培养的RPE细胞抗角蛋白染色表现为几乎所有细胞胞质中呈现浓淡不一的棕黄色着色.在IL-1β的刺激下，RPE细胞IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-αmRNA表达表现为胞质中浓淡不一的紫蓝色（Fig1，2），而未经刺激的细胞则只有很少的细胞呈现淡蓝色.在LPS的刺激下IL-6mRNA表达量稍低（Fig3，4），增加LPS剂量至20mg・L-1 仍不能增加其染色强度.
图像分析结果显示在IL-1β和LPS刺激下IL-1β（97±15，101±23），IL-8（104±19，111±19）和TNF-αmRNA（90±21，100±26）染色的吸光度没有明显差异（P&>0.05）.IL-1β和LPS刺激后RPE表达IL-6mRNA的吸光度为108±18和35±14，二者之间有显著性差异（P&<0.01）.
3 讨论
我们在研究中用原位杂交的方法对培养RPE进行检测，结果证实培养的人RPE在炎性介质刺激下可以表达IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-α的mRNA.以往对于PVR的多数研究主要是利用酶联免疫吸附法和免疫组织化学法检测患者的PVR膜和玻璃体液［2-8］ ，多数是针对炎前因子的蛋白质进行研究.也有少数用原位杂交的方法，但是体内实验无法表明其细胞来源.用ELISA和RT-PCR对于培养RPE的观察表明RPE可以表达IL-1β等炎前因子［11-15］ ，但是这两种方法有其缺点，ELISA法主要用于定量，对于无活性的物质也无法区别，RT-PCR影响因素比较多，二者均不能进行细胞内原位观察. 转贴于 我们用原位杂交方法对培养的RPE观察，既容易控制也可以进行原位观察，方法敏感.本研究观察到在IL-1β或者LPS的刺激下，RPE可以表达炎前因子的mRNA，但是用LPS刺激细胞后IL-6mRNA的染色较浅，与IL-1β刺激后IL-6mRNA表达有显著性差异，说明LPS不是IL-6mRNA的刺激因子.Elner等［11］ 和Benson等［12］ 用LPS刺激RPE细胞，没有增加IL-6的mRNA表达，结果与本实验接近.PVR的本质是机体对损伤的过度修复反应，是与炎症和免疫有关的以时相为的特征的程序化过程，大致可以分为炎症期、增生期和瘢痕期［1］ .炎症期RPE细胞分泌的细胞因子可能在趋化细胞移动、启动细胞增殖、分泌胶原和PVR形成的早期起重要的作用.在对大量玻璃体切割液的标本中发现PVR眼玻璃体腔中IL-1，IL-6，IL-8和TNF-α等不同程度的升高.对于PVR眼视网膜前膜的观察也有类似的发现.据我们所知，PVR的确切机制还不清楚，玻璃体中这些细胞因子的来源也不清楚.我们的研究结果显示在IL-1或者LPS刺激后6h，RPE就会表达IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-α的mRNA，说明RPE在受炎性介质刺激的早期就能表达炎症早期的一些细胞因子.因此我们推测在孔源性视网膜脱离后，RPE脱落游离于玻璃体腔中，通过自分泌和旁分泌IL-1β等炎前因子，趋化巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞，引起修复性反应.关于细胞因子在炎症和免疫反应中的调节功能虽然已经有论述［16］ ，但是它们在PVR中的相互关系还不明了.Kauffmann等［17］ 和Elner等［6］ 发现IL-6和IL-8在PVR眼的玻璃体中持续增高，由于IL-8的主要功能是白细胞趋化，所以我们认为可能IL-1β，IL-6和TNF-α不直接趋化白细胞，它们通过诱导RPE等分泌IL-8和MCP-1等实现趋化作用.IL-1β和IL-6可能主要介导RPE移行、增殖和分化等，IL-1β又是IL-6的诱导剂，它们的功能相互交叉.
图1 －图4 略
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