作者：郝丽丽 钱宗才 梅其炳 张邦乐
摘 要:目的 研究环氧合酶-2（COX-2）和配体复合物结构中药物小分子的能量及构象变化，为选择性COX-2抑制剂的研究奠定基础. 方法 从PDB库中提取COX-2与选择性抑制剂（SC-588）作用复合物的X-线晶体结构，在由美国Tripos公司提供的Alchemy2000平台上，剥离与之结合的药物小分子SC-588，然后同孤立态优势构象进行能量及性质比较. 结果 复合物晶体结构中药物分子的低能构象及其孤立态优势构象在能量和性质上均有差异. 结论 分子活性构象并不一定是低能构象，其能量往往介于孤立态能量和复合物结合状态时最低能量之间，根据活性构象可设计新型药物分子.
Keywords:oxygenases/antagonists&&inhibitors;computer-aided design;drug design;energy minimization
Abstract:AIM To study the changes of small molecular en-ergy and conformation in Cox-2-selective inhibitor design.METHODS Molecular structure of Cyclooxygenase-2（COX-2）was found on the internet protein database and the file was dounloaded with the molecular coordinates for COX-2，and entered Alchemy2000.The selective inhibitor（SC-558）was extracted completely from the SC-558/COX-2com-plex.The static energy and molecular property were calculat-ed in optimized and unoptimized conformations in an isolated situation.RESULTS Optimized conformation and isolated conformation were different in energy and property.CON┐CLUSION Molecular energy in active conformation usually is not the minimum energy，but between optimized and iso-lated situation.We may design the new molecule based upon the active conformations.
0 引言
非甾体抗炎药（NSAIDS，nonsteroidal antiin-flammatory drugs）通过抑制环氧合酶催化的花生四烯酸炎症介质前列腺素，达到解热、镇痛及治疗多种炎症的目的.环氧合酶有两种异构酶［1-3］ ，环氧合酶-1（cyclooxygenase-1，COX-）和环氧合酶-2（cy-clooxygenase-2，COX-2）.COX-1主要存在于正常的细胞组织中，催化产生维持正常生理功能的前列腺素;诱导性的COX-2主要存在于炎症组织细胞中，在炎症介质的诱导下产生的COX-2催化花生四烯酸，产生致炎前列腺素，加重炎症反应.研究COX-2选择性抑制剂成为开发高效、低毒副作用的NSAIDs的新途径.计算机分子模拟技术和理论化学计算方法在合理的药物设计得到广泛的应用.利用计算机模拟这一方便而实用的现代技术，我们可以在计算机屏幕上方便快捷地建造、分析和修改分子结构并利用三维技术实时显示其立体结构，计算分子能量和立体化学性质及物理化学性质，推算出各种低能构象，进行构象分析并与酶模型相结合，对结构进行优化，由此推断其活性构象，设计新的药物分子.
1 理论基础和方法
1.1 理论基础 能量极小化方法基于如下思想，认为分子势能最低构象是最稳定的构象，分子势能是坐标的函数，通过改变坐标求势能极小值就可得到低能的稳定构象［4］ .Alchemy2000中能量最小化程序用来测定分子中各原子不同位置时分子不同构象时的能量，以下是其测得最小能量结构时应用的参数，最小值是指分子构象发生任何小的变化即引起能量增加时的构象，梯度值是原子处于笛卡尔坐标下能量的一阶导数，当梯度为零时，处于分子表面上的点为定点，鞍点是指分子的空间结构发生局部变化而导致分子能量变化时的构象.Alchemy2000中能量最小化程序报告的极小值是指比输入程序时构象更稳定时的能量值，并不是绝对意义上的能量最小值.本程序利用分子力学方法进行构象分析、优化、计算分子能量时，计算的是分子立体和非键相互作用，即E=Estr +Eang +Etor +Evdw +Eoop +Eele 其中E分子总势能，Estr 共价键伸缩的振动能，Eang 键角弯曲的振动能，Etor 二面角扭转能，Evdw 范德华作用能，Eoop 成键超平面势能，Eele 静电势能.计算过程中运用的力场参数均为Tripos标准力场，这些都是依据经验势函数进行计算的，不同的计算方法可以用不同的经验势函数.力场参数可通过理论计算和实验数据拟合得到，根据经验势函数形式和拟合方法不同，可得到不同的力场.
1.2 方法
1.2.1 软件安装 Alchemy2000是由美国Tripos公司提供的最早用于计算机辅助分子设计的PC版桌面操作平台.硬件需求，至少8MB内存，推荐使用16MB内存，至少40MB硬盘空余空间，SVGA显示器，Windows3.1或Windows95或Windows98系统.
1.2.2 下载COX-2坐标系文件 第一步获得COX-2结构，将流览器连接到Datebase-Bookhaven数据库，输入四个字符的COX-2蛋白质识别代码（6COX），进入Down/Display界面下载非压缩的PDB格式文件，以*.PDB格式另存在磁盘上.
1.2.3蛋白结构输入Alchemy2000，剥离SC-558小分子 以*.PDB格式将下载文件输入Alche-my2000中，利用软件对复合物晶体结构进行着色，我们可以清晰地观察到，COX-2是由两条完全相同的空间结构完全一致的肽链构成，分别有自己独立的活性位点，结合区域，且两个配体结合位点彼此远离，可见，两个配体与酶的相互作用是相对独立的.此时通过Build模式转换可将*.PDB转换为小分子格式*.al2，然后将小分子SC-558移至新打开的小分子窗口，不做任何改变，对其进行动力学性质计算.
1.2.4 静态能及分子性质计算 用上述同样的方法，再分离出一个SC-558分子，移至新的窗口，对其进行动力学几何优化处理，计算单点静态能并进行分子性质计算.整个计算过程均为Tripos标准力场.
2 结果
孤立态优化分子SC-558同复合物晶体结构中SC-558分子性质参数，构象键角变化分别列于Tab1，Tab2.孤立态优化后分子SC-558各原子排列如Fig1，同复合物晶体结构中SC-558分子叠合如Fig2.
表1 复合物晶体结构中SC-558同孤立态优化后分子性质参数同能量比较 略
3 讨论
本文数据说明分子处于孤立态能量和最低能量时，分子中各键角有明显差异，可见两者构象是不同的.Fig1可见，键角改变是分子中单键旋转造成各原子空间排列状态不同引起的.不同能量的构象与相适应的酶相互作用，便可产生不同的药理作用.Tab1中分子容积、表面积及能量的差异正是因为不同构象中各个相互作用的原子或基团间距离不一，使得整个分子空间立体结构及能量发生改变，药物分子的构象变化与生物活性间有重要关系，这是因为药物小分子与大分子的酶间相互适配、诱导契合中构象的互补性.孤立态优化后SC-558分子同复合物晶体结构中SC-558分子叠合发现，同酶作用后分子结构发生改变，说明药物与酶结合不一定均以最低能量的构象形式.孤立态的分子总是处于能量最低状态，即具有能量最低的构象，药物分子与酶作用时，虽然不处在能量最低，但它一定是某一能量优势构象［5］ ，与酶结合的构象称作活性构象，其能量往往介于孤立态能量和最低能量之间［6］ .COX-2的晶体结构已经确定，并已知与抑制剂的结合位点［7-8］ ，它已成为当前最引人注目的抗炎治疗新靶点，COX-2选择性抑制剂设计中，对已知三环系COX-2抑制剂进行改造是一条有效途径，其三维结构可利用优化后的SC-558为模板，取代相应的基团和原子后，通过分子力学优化后得到.通过孤立态能量计算，推算低能量的各种构象尔后与酶模型结合，其互补最佳者，即为药物分子的活性构象，根据活性构象可设计新型药物分子.
图1 略
在已经获得了不少体内有重要生理作用的酶的晶体结构数据的基础上，合理药物设计领域正在开展着越来越多的基于酶结构的小分子研究.然而，仅仅利用酶的静态结构很难直接设计出有效的酶抑制剂，因为生物体内所有化学反应几乎都是在酶的催化下进行的，酶是生物催化剂，所以酶抑制剂的设计一定要进行酶促反应动力学分析，既要分析反应催化部位又要检测可能的中间产物，致力于发现酶活性中心的构象互补物及反应的过渡态类似物来深入了解酶与 底物的结合机制，基于酶与底物的结合机制来设计酶抑制剂.这样设计出的化合物抑制作用要比基于酶静态结构设计的抑制剂活性高出几个数量级［9］ ，可见，酶抑制剂设计不但需要酶的结构、功能而且要清楚它与药物作用的方式以及产生生理活性的机制.计算机科学的不断进步以及量子化学、分子力学、分子动力学与药物科学的渗透使计算机科学中的数据库、图形学及人工智能广泛应用于药物分子和生物大分子的三维结构研究，为构象分析、两者作用模式和机制的推测以及构效关系的研究等提供了先进的手段和方法.合理药物设计是在分子甚至电子的水平上进行研究，需要先进的技术支持，计算机辅助药物设计综合并藉助多学科的先进技术、方法和成果，为合理药物设计提供强有力的基本工具和手段，计算机辅助药物设计这门新兴学科，使药物设计进入直观设计的新阶段.
图2 略
参考文献
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