关键词: 重症肌无力;受体，胆碱能;抗体;基因，Fos;中枢神经系统
摘 要:目的 探讨重症肌无力（MG）中枢神经系统（CNS）损害机制. 方法 从AChRab阳性的全身型MG患者血清中提取纯化IgG，然后注入大鼠侧脑室，应用免疫组织化学方法，观察即早基因c-fos的表达. 结果 脑室内注入AChRab后，大鼠皮层、海马、下丘脑等部位出现显著的Fos表达. 结论 c-fos基因参与MG中枢损害过程.研究表明皮层、海马、下丘脑等部的神经元极可能涉及MG中枢损害时的病理生理过程.
Keywords:myasthenia gravis;receptors，cholinergic;anti-bodies;genes，Fos;central nervous system;rats
Abstract:AIM To explore the mechanism of central ner-vous system（CNS）dysfunction in myasthenia gravis（MG）.METHODS c-fos expression was investigated in rat CNS neurons by immunohistochemical method following intracere-broventricular administration of IgG purified from MG pa-tient sera.RESULTS Strong expression of Fos was found in the cerebral cortex，hippocampus，hypothalamus et al after intracerebroventricular administration of IgG（AChab）.CONCLUSION It is concluded that c-fos may be related to the mechanism of CNS dysfunction in MG.
0 引言
重症肌无力（MG）主要的致病机制是患者体内存在的乙酰胆碱受体抗体（AChRab）与神经肌肉接头（NMJ）处的乙酰胆碱受体（AChR）结合，而引起NMJ处乙酰胆碱（ACh）传递障碍［1］ ，出现肌无力等临床症状.然而，有研究表明MG病变部位并不局限于NMJ处.有研究表明，部分MG患者伴有中枢神经系统（CNS）的异常，如锥体束征、癫痫、精神症状、记忆认知障碍［1-7］ 及脑电图及脑干诱发电位异常［8-10］ .Brenner等将从MG患者血清中提取的IgG注入大鼠侧脑室，发现其不仅影响下丘脑-垂体-肾上腺轴的功能，而且还出现MG模型样症状［11］ .此外，Lefvert等的研究表明，MG患者脑脊液中存在AChRab［12］ .上述研究提示MG患者AChab可引起CNS功能异常，但机制不甚明了.为进一步探讨MG的CNS受损机制，作者用MG患者AChab进行免疫组化研究发现，AChab可与CNS神经-AChR免疫交叉结合［13］ .本项研究，以能够反映神经元功能变化的原癌基因c-fos的表达作为神经元兴奋的指标，观察其在大鼠MG中枢损害时的变化，以求进一步在形态学上探寻MG CNS受损的证据.
1 材料和方法
1.1 实验动物 用成年雄性SD大鼠24只，体质量200～250g，（由本校实验动物中心提供），安静数天，给予充足、清洁的饮水，严密观察摄食和健康状况.实验组大鼠14只，对照组10只.
1.2 提取IgG 选择具有典型MG临床症状，抗胆碱酯酶药物实验和血清AChRab阳性的全身型MG患者为抽血对象.取患者血清10mL，用硫酸铵盐析法及亲和层析法提取IgG.另取健康人血清10mL，提取IgG，方法同上，作为对照.
1.3 大鼠脑室内注射IgG 选成年SD大鼠14只，用10g L-1 戊巴比妥钠经腹腔麻醉（30～40mg kg-1 体质量），固定于立体定向仪上，切开颅顶皮肤，暴露颅骨.自Bregma点向后1.3mm，向左旁开1.3mm处为脑室穿刺点.钻颅，自脑表面进针4.0mm，缓慢注入25uL MG患者IgG，隔日1次，共3次.对照组脑室内注入正常人IgG，方法同上.观察脑室内注入IgG前后SD大鼠行为变化，如摄食、体质量、四肢运动、呼吸频率及动度等.
1.4 组织准备 第三次注射IgG后5h，用10g L-1戊巴比妥钠经腹腔麻醉SD大鼠，经主动脉灌注40g L-1 多聚甲醛固定;取脑组织，置于200g L-1 蔗糖溶液中过夜;冰冻切片，片厚40nm.
图1 － 图6 略
1.5 免疫组织化学 先用PBS洗切片，10min×3次，入含3g L-1 TritonX-100的PBS中，室温下30min，然后入Fos抗体（美国Santa-Cruz公司，1 1000稀释），4℃下孵育36～72h;以PBS洗切片，10min×3次，入生物素化的羊抗兔二抗（美国Dako公司，1 500稀释），室温下孵育4h，PBS洗，10min×3次;再入ABC复合物（美国Dako公司，1 500），室温下孵育2～4h，PBS洗切片，10min×3次，再用硫酸镍铵强化法呈色.最后脱水、透明、封片（Fig1～6）.
1.6 图象分析 以Quantimet570图象分析系统（Leica公司）进行分析，分别计4张下丘脑、海马及皮层平面的Fos免疫反应细胞.
2 结果
实验组SD大鼠脑室内第3次注入MG患者IgG后脑内有多个脑区可以见到大量的Fos阳性神经元.第3次注射后3h，大脑皮层、基底节、丘脑、海马、脑干各颅神经运动核团、听神经核、小脑皮层，下丘脑外侧区、穹隆、隔区、扣带回、海马、丘脑、乳头体、黑质、红核、纹状体等即有Fos表达，4～5h时Fos表达达到高峰，12h后除大脑皮层、下丘脑、海马等部分脑区外，大部分脑区的Fos表达消退明显.因此，本项研究选择第3次注入IgG后5h，这一时间点进行观察.经图象分析（Tab1）.
表1 Fos免疫反应阳性细胞数 略
3 讨论
近年来，在nAChR研究领域里提出ACh-门控-离子通道超基因家族概念.这个基因家族编码两大类受体:①肌-nAChR，是由4种亚单位组成的五聚体，即2α1 ，β1 ，γ，δ.②神经元-AChR，仅由α，β两种亚单位组成，各亚单位根据其编码基因不同又分为多种亚型.神经元-AChR广泛分布于脊椎动物的皮层、基底节、丘脑、下丘脑、中脑、脑干、小脑、脊髓及植物神经节等部位［14-17］ .肌-AChR和神经-AChR同属于ACh-门控-离子通道超基因家族，两者的α亚单位氨基酸组成同源性高达90%［14］ .分子克隆显示人与大鼠的神经-α3 ，α5 ，β2 ，β3 ，β4 之间也具有很高的同源性［18］ .另外，有研究表明MG患者AChRab可与大鼠和猴CNS神经-AChR免疫交叉结合.神经- AChR样免疫阳性反应广泛分布于大鼠CNS许多部位，如大脑皮层、脑干各颅神经运动核团、听神经核、小脑皮层、脊髓前角运动神经元等部位.
3.1 摄食行为的变化
下丘脑外侧区被认为是摄食中枢，腹内侧核被认为是饱食中枢.中枢神经递质ACh分别调节摄食和饮水活动，但两者往往并存.将甲酰胆碱注入大鼠边缘系统不同部位，如下丘脑外侧区、穹隆、隔区、扣带回、海马、丘脑、乳头体等部位，均可诱发大鼠饮水活动，继之以摄食活动.上述部位之间通过纤维联系形成环路，即胆碱能喝饮回路.予以胆碱能受体阻滞剂（阿托品或东莨菪碱）可以阻断ACh或氨甲酰胆碱诱发的饮水活动，予以胆碱能受体激动剂（毒扁豆碱）引起内源性ACh蓄积，从而诱发饮水活动.提示ACh通过激活分布于边缘系统的神经-AChR，促进大鼠摄食和饮水活动.此外，在家兔实验中，将小剂量氨甲酰胆碱注入下丘脑外侧区可诱发饮水，而大剂量则诱发摄食.故本试验中大鼠摄食行为的改变可能是与侧脑室内注入的AChRab作用于下丘脑、边缘叶等处的神经元-AChR，抑制下丘脑摄食中枢有关;或是通过突触前膜的调节机制，抑制有关神经递质的释放，引起大鼠摄食和饮水行为的改变.
有研究表明神经-AChR弥散分布于下丘脑、边缘叶等部位.神经-AChR亚单位亚型α7 弥散分布于整个下丘脑，尤以内侧区密度最高［19］ .而α7亚型有以下特点:①可以被α-BuTx阻断，其特征与肌-AChR类似;②可以被中枢谷氨酸-门控-Cl-通道拮抗剂所抑制;③对Ca2+ 具有高度通透性;④人与大鼠的α7亚型氨基酸序列具有很高的同源性［20］ .α4 ，β2 亚型也多见于下丘脑外侧区.而与摄食活动有关部位的神经-AChR主要由α4 ，α7 ，β2 亚型组成，当AChRab与下丘脑、边缘叶等摄食活动有关部位的神经元突触前膜α7 亚型结合，就有可能阻断正常的细胞外Ca2+ 对AChR功能的调节，以及ACh对其受体的激活作用，从而使摄食中枢受到抑制，使大鼠摄食量减少，体质量下降.另外，Wada等用原位杂交方法研究［21］ ，三叉神经运动核和疑核等以神经-AChR亚型α3 ，β2 分布为主，而α2 ，α4 密度极低.单抗免疫组化研究显示，上述两核中α7 亚型免疫反应呈强阳性，说明这两组颅神经运动核中神经-AChR主要是由α3 ，α7 ，β2 组成.Schoepfer研究表明α3 亚型主要位于突触后膜，具有典型的突触后膜受体功能，类似于NMJ处的肌-AChR.因此，被AChRab阻断后，均可引起ACh传递障碍，引起咀嚼肌、咽喉肌的无力，导致咀嚼和吞咽困难，影响大鼠进食，进一步造成大鼠摄食量减少，体质量下降.本实验发现，在下丘脑，尤其是内侧、海马等部位有Fos表达，说明了这些部位的神经元被激活，为上述实验提供了形态学上的证据. 转贴于 3.2 运动功能的改变 有研究结果证实，大脑皮层Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ层和脑干颅神经运动核团，以及脊髓前角细胞运动神经元上均有多种神经-AChR亚单位亚型分布，以α4 ，α7 ，β2 亚型分布量最多、最广［21］ .神经-AChR亚单位亚型也广泛分布于锥体外系，如黑质、红核、纹状体、小脑等.在CNS中，由相同或不同的亚单位亚型，组成功能相同或不同的神经-AChR;绝大多数神经-AChR位于突触前膜，起突触前调节作用.Peerrins等研究发现，脊髓内中枢运动神经元突触为化学突触，其突触传递是由神经-AChR介导的［22］ .Khan等对大鼠脊髓神经-AChR的分布及药理特性做了深入的研究，发现神经-AChR激动剂作用于脊髓，可引起多种心血管和行为学方面的变化，于是提出脊髓的受体是神经-AChR家族的一员［23］ .本实验结果显示，阳性的Fos染色分布于大脑皮层神经元和锥体系，说明注入脑室内的MG患者AChRab可作用于运动系统，引起神经冲动传递障碍，出现MG样表现.
参考文献
［1］Zhang H，Xue XH，Guo H，Su T，Wang XY，Sun H，Zhang ZHX，Tang MX.Systemic manifestations of myasthenia gravis and its putative pathogenesis ［J］.Zhonghua Neike Zazhi（Chin inter Med J），1997;36（6）:368-371.
［2］Badurska B，Ryniewicz B，Kowalski J.Epileptic seizures in chil-dren with myasthenia gravis ［J］.Neurochir Pol，1991;25（3）:326-331.
［3］Musha M，Tanaka F，Ohuti M.Psychoses in three case with myasthenia gravis and thymoma proposal of a paraneoplastic au-toimmune neuropsychiatric syndrome ［J］.Tohoku J Exp Med，1993;169（4）:335-344.
［4］Iwasaki Y，Kinoshita M，Ikeda K，Shiojima T，Kurihara T.Neuropsychological function before and after plasma exchange in myasthenia gravis ［J］.J Neurol Sci，1993;114（2）:223-226.
［5］Tucker DM，Roeltgen DP，Wann PD，Wertheimer RI.Memory dysfunction in myasthenia gravis:evidence for central choliner-gic effects ［J］.Neurology，1988;38（8）:1173-1177.
［6］Iwasaki Y，Kinoshita M，Ikeda K，Takamiya K，Shiojima T.Cognitive dysfunction in myasthenia gravis ［J］，J Neurol Sci，1990;54（1-2）:29-33.
［7］Davidov-Lusting M，Klinghoffer V，Kaplan-Dinur A，Steiner I.Memory abnormalities in myasthenia gravis:Possible fatigue of central nervous system cholinergic circuits ［J］.Autoimmunity，1992;14（1）:85-86.
［8］Saphier D，Birmanns B，Brenner T.Electroencephalographic changes in experimental autoimmune myasthenia gravisv ［J］.J Neurol Sci，1993;114（2）:200-204.
［9］Watanabe S，Shimazu K，Tamura N，Yamamoto T，Hamaguchi K.Central acetylcholine receptor function in patients with myasthenia gravis ［J］.Rinsho Shinkeigaku，1991;31（2）:170-174.
［10］Fu XF，You GX，Shi YK，Li ZhY.Studay of brainstem audito-ry evoked potential in myasthenia gravis ［J］.Zhongguo Shenjin Jinshen Jibing Zazhi（Chin Nerv Ment J），1992;18（6）:368-369.
［11］Brenner T，Mizrachi R，Bodoff M，Weidenfeld J.Evidence that central nicotinic acetylcholine receptors are involved in the mod-ulation of basal and stress-induced adrenocortical responses ［J］.Exp Neurol，1986;94（3）:735-743.
［12］Brenner T，Mizrachi R，Bodoff M，Weidenfeld J.Acetylcholine receptor antibodies in cerebral fliud of patients with myasthenia gravis ［J］.Lancet，1977;1（3）:351-354.
［13］Li ZhY，Qiu XF，Ju G.Central nervous system dysfunction model myasthenia gravis ［J］.Zhonghua Shenjinke Zazhi（Chin Neurol J），1997;30（9）:218-220.
［14］Lindstrom J，Schoepfer R，Conroy W，Whiting P，Das M，Sae-di M，Anand R.The nicotinic acetylcholine receptor gene fami-ly:Structure of nicotinic receptors from muscle and neurons al-pha-bungarotoxin-binding proteins ［J］.Adv Exp Med Biol，1991;287（13）:255-278.
［15］Wada E，Wada K，Boulter J，Deneris E，Heinemann S，Patrick J，Swanson Lw.Distribution of alpha2，alpha3，alpha4and beta2neuronal nicotinic receptor subunit mRNA in the central nervous system:A hybridization histochemical study in the rat ［J］.J Comp Neurol，1989;284（2）:314-335.
［16］Hill JA JR，Zoli M，Bourgeois JP，Changeux JP.Immunocy-tochemical localization of a neuronal nicotinic receptor:the beta2-subunit ［J］.J Neurosci，1993;13（4）:1551-1568.
［17］Rubboli F，Court JA，Sala C，Morris C，Chini B，Perry E，Clementi F.Distribution of nicotinic receptors in the human hip-pocampus and thalamus ［J］.Eur Neurosci，1994;6（10）:1596-1604.
［18］Willoughby JJ，Ninkina NN，Beech MM，Latchman DS，Wood JN.Molecular cloning of a human neuronal nicotinic acetyl-choline receptor beta-3like subunit ［J］.Neurosci Lett，1993;155（2）:136-139.
［19］Rubboli F，Court JA，Sala C，Morris C，Perry E，Clementi F.Dis-tribution of neuronal nicotinic acetylcholine receptor subunit in the human brain ［J］.Neurochem Int，1994;25（1）:69-71.
［20］Chini B，Raimond E，Elgoyhen AB，Moralli D，Balzaretti M，Heinemann S.Molecular cloning and chromosomal localization of the human alpha7-nicotinic receptor subunit gene（CHRNA7）［J］.Genomics，1994;19（2）:379-381.
［21］Wada E，Wada K，Boulter J，Deneris E，Heinemann S，Patrick J，Swanson LW.Distribution of alpha2，alpha3，alpha4，and beta2neuronal nicotinic receptor subunit mRNAs in the central nervous system:a hybridization histochemical study in the rat ［J］.J Comp Neurol，1989;284（2）:314-335.
［22］Perrins R，Roberts A.Related Articles.Cholinergic and electri-cal synapses between synergistic spinal motoneurones in the Xenopus laevis embryo ［J］.J Physiol，1995;485（1）:135-144.
［23］Rust G，Burgunder JM，Lauterbury TE，Cachelin AB.Expres-sion of neuronal nicotinic acetylcholine receptor subunit genes in the rat autonomic nervous system ［J］.Eur J Neurosci，1994;6（3）:478-485.