作者：颜真 张英起 李波 赵宁 石继红 韩苇 王利兵 王增禄
【关键词】 重组
关键词: 重组，遗传;大肠杆菌;发酵;肿瘤坏死因子;肽类
摘 要:目的 探讨重组肿瘤导向多肽LTL-TNF工程菌的大规模培养与表达方法以获取重组LTLTNF. 方法 首先在试管和三角瓶中探讨工程菌的生长和表达规律，筛选其最适宿主菌、最佳培养及诱导表达条件，然后在5L自控发酵罐中进行分批补料培养. 结果 保持培养过程中30%～40%的溶解氧和限制性流加葡萄糖，工程菌DH5α/pBV-LTLTNF在5L发酵罐中培养至终密度A600nm 40～50时，目的蛋白的表达最高，可达菌体总蛋白的50%，LTL-TNF的含量达到5.12g・L-1 ，发酵总时间在12h左右. 结论 确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺，为重组肿瘤导向多肽LTLTNF工程菌的工业化生产奠定了基础.
Keywords:recombination，genetic;Escherichia.coli;fermen-tation，tumor necrosis factor;peptides
Abstract:AIM High cell density cultivation research on re-combinant E.coli to produce recombinant tumor targeting peptide LTL-TNF.METHODS To determine its optimized host cell，culture and induction condition，this research first focused on understanding the growth and expression specifici-ty of recombinant LTLTNF on test tube and flask shaker.Then the fed-batch culture was carried out on5L automatic fermentor.RESULTS By keeping dissolved oxygen at30%～40%and limiting glucose feeding during fermentation，the recombinant protein LTLTNF production of DH5α/pBV-LTLTNF in5L fermentor reached5.12g・L-1 ，about50%of total amount of bacterial proteins，with the final cell densi-ty of A600nm 40～50in around12h.CONCLUSION A short cycle，high expression and stabilized fermentation process of recombinant LTLTNF has been established.
0 引言
针对肿瘤抗原和肿瘤血管的抗肿瘤治疗研究是目前肿瘤治疗研究的热点.人黑色素瘤蛋白多糖（human melanoma proteoglycan，HMP）及其大鼠的同源蛋白NG2分别于1991和1996年被鉴定和克隆［1，2］ ，HMP/NG2主要表达于成年动物的肿瘤细胞和肿瘤血管细胞表面，而不表达于正常组织，HMP/NG2表达增高可促进黑色素瘤的增殖［3］ ，抗NG2抗体在体内和体外均显示出抑制黑色素瘤细胞及肿瘤血管生长的特性［3，4］ ，故HMP/NG2已成为肿瘤治疗的靶向目标.LTL十肽可特异性地结合HMP/NG2抗原，从而阻断HMP/NG2的作用［5］ .为了更好地发挥LTL肽的抗肿瘤作用，我们构建了LTL肽与新型重组人肿瘤坏死因子（new type recombinant human tumor necrosis factor，nrhTNF）融合蛋白的重组表达载体，并在大肠杆菌中获得了该融合蛋白的表达，为了大量获取LTLTNF，以配合动物实验和临床试验，我们对重组LTLTNF工程菌的生长与表达规律进行了探索，建立了稳定的高密度发酵工艺.
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 重组质粒与宿主菌 重组质粒pBV-LTLT-NF由第四军医大学生物技术中心构建和保存，含LTL十肽的核酸编码序列和编码突变型人肿瘤坏死因子α（nrhTNF）的基因序列［6］ ，受PL PR 双重启动子控制，在42℃时能诱导LTLTNF融合蛋白的表达，具有氨苄抗性.
宿主大肠杆菌E.coli JM109［recA1supE44en-dA1hsdR17gyrA94relA1thi△（lac-proAB）F’（t-raD36-prDAB+lacIq lacZ△M15）］，E.coli DH5α［supE44△lacU169（Φ80lacZ△M15）hsdR17recA1endA1gyrA96thi-1relA1］由第四军医大学生物技术中心保存，E.coli YK537（supE44hsdR hsdM re-cA1phoA8leuB6thi lacy rpsL20galK2ara-14xyl-5mth-1）由中科院上海生物工程中心提供.
1.1.2 培养基 LB培养基用于试管种子培养［7］ ，含葡萄糖的2YT培养基用于摇瓶培养［7］ ，半合成培养基用于5L发酵罐中分批补料培养［8］ .补料基质含有（g・L-1 ）:Trypton80，Yeast Extract40，Glycerol400，MgSO4 ・7h3 O5.
1.1.3 仪器 Biostat C5L自动发酵罐，德国B.Braun公司;J-6B型大容量冷冻离心机，Bechman公司产品;微量蛋白电泳仪，Bio-Rad公司产品;Ultrascan XL灰度扫描仪，LKB产品.
1.2 方法
1.2.1 发酵用菌种筛选 pBV-LTLTNF质粒DNA分别转化宿主大肠杆菌JM109，DH5α，YK537，30℃培养过夜，挑单菌落于5mL LB试管中，30℃200r・min-1 振摇培养至A600nm 0.6左右，42℃诱导表达.
1.2.2 摇瓶培养 将试管活化种子按20mL・L-1 接种于含150mL2YT的500mL摇瓶中，30℃，200r・min-1 振摇培养至对数中期，42℃诱导表达，或作为5L发酵罐的二级菌种.
1.2.3 5L自控发酵罐中分批补料培养 将二级种子液按40mL・L-1 接种至发酵罐.控制参数为:①溶氧及转速控制溶氧≥30%，达到最大转速后，通入纯氧;②温度诱导表达前控制为30℃，诱导表达后控制为42℃;③pH值设定为7.0，自动流加300mL・L-1 氨水以保持恒定.
1.2.4 重组蛋白LTLTNF表达量测定 常规SDS-PAGE分析，灰度扫描仪分析重组蛋白占菌体总蛋白的百分含量.
2 结果
2.1 最适宿主菌筛选 将重组质粒pBV-LTLTNF分别转化三种不同宿主菌JM109，DH5α及YK537，在三角瓶中模拟发酵罐中的补料培养，在诱导前加入10mL补料培养基，调pH至7.0.结果，转化的 YK537和DH5α的生长速度及表达重组蛋白的量相似，表达量均达到菌体总蛋白的50%，JM109生长较慢，表达量约占菌体总蛋白的40%（Fig1）.
图1 略
2.2 三角瓶培养中诱导表达时间的优化 30℃三角瓶培养至对数中期（A600 =0.6），升温至42℃诱导重组蛋白的表达，每0.5h取样一次，SDS-PAGE分析表达情况.结果表明诱导0.5h后外源蛋白即开始表达，表达水平在3h内迅速提高，4.5h达到高峰，6h后开始下降，菌体密度也有所降低.由此确定发酵结束时间可以在诱导后4～5h，控制在菌体密度开始下降前.
2.3 三角瓶培养中起始诱导时机对DH5α/pBV┐LTLTNF生长和重组蛋白表达的影响 在细菌生长的对数中期（培养6h）升温诱导，可获得较高的重组蛋白表达，比早期和后期诱导均有明显提高（Tab1），这是因为在对数生长后期，营养的消耗和生长环境恶化可能导致外源基因表达能力的降低.
表1 三角瓶培养中不同诱导时机对菌体终密度和LTLTNF表达量的影响 略
2.4 5L发酵罐中DH5α/pBV┐LTLTNF工程菌的高密度高表达培养 采用分批补料培养方式，在Bio-stat C5L自控发酵罐中进行.在线控制pH7.0，溶解氧≥30%.补料流加分3个阶段:0～4h不加，4～8h设补料速度为40mL・h
-1 左右，8～17h70mL・h-1 左右.30℃生长，42℃诱导表达，诱导生长4.5h后收菌.Fig2和Fig3分别显示发酵至A600nm 50时的在线控制图和SDS-PAGE电泳检测重组蛋白表达图.从图中可见4～9h是细菌生长的旺盛时期，此阶段细菌的比生长速率μ在0.2h-1 ～0.6h-1 之间，第8h开始升温，诱导LTLTNF的表达，2h后细菌生长明显减慢，μ降至0.13h-1 ，说明诱导后细菌的能量主要消耗在外源基因的表达上，特别是诱导后第2h，LTLTNF蛋白占菌体总蛋白的含量从18%陡升至36%，4h后表达量达到50%.
图2 － 图3 略
在发酵罐中LTLTNF重组菌的发酵随着培养密度增加，表达量呈锺罩形变化，当A600nm 值超过60时，表达量有较明显降低.Tab2显示不同生长密度下重组蛋白表达的结果.
3 讨论
重组DNA技术和大规模培养技术的有机结合，使得原来无法大量获得的天然蛋白和重组蛋白已可大量生产，并成功地应用于科研和制药工业等［8-10］ . 要提高重组蛋白的产率，不但要求重组大肠杆菌高水平地表达外源蛋白，而且要提高菌体密度，最终提高产物的比生产率.
这一目的的实现，除了合适的宿主菌、重组菌质粒的稳定性高、拷贝数多、理想的重组基因表达调控、产物的高表达水平外，还必须赋予重组菌生长和产物表达的最适环境条件，包括适宜的培养基组成、合适的培养温度、pH，稳定的比生长速率、适宜的溶解氧以及营养物的合理流加等［9，11］ ，因此设计、控制工程菌的发酵过程中都必须考虑这些参数.
大肠杆菌的不同种和亚种对外源基因的表达产物会产生一定的影响，包括对表达产物的稳定性、代谢产物的积累等，并最终影响到细菌的生长密度［12，13］ .因此，在高密度发酵优化时应该考虑宿主菌的因素，选取最合适的表达宿主菌.
微生物的培养按方式不同可分为:分批培养、分批补料培养、连续培养三种.传统的分批发酵技术所能得到的菌体密度很低，究其原因是培养过程中营养物质的过渡消耗和有害代谢产物的积累，导致菌体生长速率的降低.连续培养技术通过不断补充新鲜的培养基，同时以同样的速率将培养液从反应器中抽出，消除了有害代谢产物对生长的抑制作用，但是会造成培养基成分未充分利用和有用培养物的流失，且由于培养时间长易发生染菌和质粒的丢失.分批补料培养技术则是在培养过程中间断补充培养基，使菌体在较长时间内保持较高的生长速率，从而达到高密度.分批补料技术已广泛应用于重组大肠杆菌以及非重组大肠杆菌的高密度发酵，且每升发酵液菌体的密度已可超过100g干重［13-15］ .
然而一般情况下，单位菌体的生产能力在高密度时往往低于低密度时［8，10］ ，这在我们以往对重组胸腺肽及重组新型人肿瘤坏死因子的发酵研究中便是如此［7，9］ .对重组LTLTNF工程菌的发酵研究，我们首先通过对试管和三角瓶培养条件的摸索，了解了该工程菌自身的生长和表达规律，然后控制发酵过程中溶解氧和碳源物质的浓度，用产酸量较少的甘油代替葡萄糖，并采用分阶段控制添加补料的步骤，降低有害废物（主要是乙酸）的积累，始终保持细菌较高的活性状态，成为DH5α/pBV-LTLTNF工程菌发酵成功的关键.
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