用PCR┐SSCP及DNA测序法分析胃癌p53基因突变

【关键词】 基因
　　关键词: 基因，p53;突变;胃肿瘤;聚合酶链式反应;银染色法;序列分析，DNA
　　
　　摘 要:目的 探讨p53基因突变与人类胃癌发生的关系. 方法 运用PCR、PCR-SSCP结合银染法对25例胃癌组织p53基因第4、第5～6和第7外显子进行突变检测;运用双脱氧链终止法对第7外显子阳性突变标本进行DNA测序. 结果 在25例胃癌组织中检出突变5例，突变率为20%;在第7外显子阳性突变标本中发现了18bp的大片段缺失. 结论 p53基因突变与人类胃癌的发生具有明显相关性，并且这种突变可能不仅仅局限于点突变，大片段缺失也是p53基因突变方式之一.
　　
　　
　　Keywords:genes，p53;mutation;stomach neoplasms;poly-merase chain reaction;silver staining;sequence analysis，DNA
　　
　　Abstract:AIM To investigate the relationship between the mutation of p53gene and human gastric cancer.METHODS Mutations in exon4～7of p53gene were examined in25cases of gastric cancer by PCR and PCR-SSCP-Silver stain-ing.In addition，Sanger method（dideoxy-mediated chain-termination method）of DNA sequencing was used to examine the exon7which was positive in p53mutation.RESULTS Mutations were found in5cases（20%），and a large frag-ment deletion of18bp was also found in exon7which was positive in p53mutation.CONCLUSION There is a strong correlation between p53mutation and human gastric cancer.Moreover，the mutation may not be confined to point muta-tion only.It can be a large fragment deletion.
　　
　　0 引言
　　
　　p53基因是一个广谱的抑癌基因［1，2］ ，大约50%的人类肿瘤与p53基因的突变、过量表达或杂合性丢失有关［3-9］ .该基因全长16～20kb，包括11个外显子，第4到第8外显子是其突变的热点区域［7，10-12］ .p53蛋白是一种Mr =53的磷酸核蛋白，野生型的p53基因对调节细胞分裂、诱导细胞的程序化死亡、抑制肿瘤细胞的生长有着重要的作用.突变后的p53基因则能促进细胞分裂和转化，从而导致肿瘤的发生.可见，它在肿瘤发生中起着一种负调控作用.胃癌是黄色人种中高发肿瘤之一，我国胃癌发病率达5～40/10万，因此对胃癌的病因学探讨和研究，对于该肿瘤的预防和治疗，有着重要的理论意义和实践价值.我们应用PCR，PCR-SSCP（PCR-Single strand conformation polymorphism）结合银染法和DNA序列分析技术，对南京地区25例胃癌患者手术切除标本进行了p53基因突变研究，首次发现在中国人胃癌中存在p53基因的大片段缺失，为胃癌的病因学提供了又一分子生物学依据.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 标本采集和DNA制备 胃癌组织及癌旁正常组织标本共25对，均取自手术切除标本，由南京铁道医学院附属医院提供，并经病理科鉴定.手术切除后的标本立即置-80℃保存备用.所有标本采用常规酚氯仿法提取基因组DNA.
　　1.2 引物序列及PCR扩增
　　1.2.1 PCR引物的选择与合成 选择p53基因突变热点第4，第5～6和第7外显子进行PCR及PCR-SSCP，其引物由上海细胞生物学研究所合成，引物序列见Tab1.
　　
　　表1 PCR扩增所用的3对引物　略
　　
　　1.2.2 PCR扩增体系 10×PCR reaction buffer5μL;5×dNTPs2μL;1对引物各1μL;模板DNA1.0μg;Taq酶1U;加h3 O至50μL，加盖石蜡油.
　　1.2.3 PCR反应循环参数 第4外显子:预变性93℃3min;变性93℃45s;退火58℃45s;延伸72℃90s;循环28cycles;延伸72℃8min.第5～6外显子:预变性93℃3min;变性93℃45s;退火58℃45s;延伸72℃90s;循环30cycles;延伸72℃8min.第7外显子:预变93℃3min;变性93℃45s;退火60～61℃30s;延伸72℃60s;循环25cy-cles;延伸72℃5min.
　　
　　1.2.4 PCR扩增产物检测 取PCR扩增产物5μL，用于20g・L-1 琼脂糖凝胶电泳，并以小分子质量marker作分子质量标记，检测PCR扩增产物的长度及纯度.
　　
　　1.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ①将玻璃板洗净干燥，选取适当的橡胶夹条，按要求装好电泳板;②配制60g・L
-1 凝胶:300g・L-1 聚丙烯酰胺母液8mL;5×TBE4mL;甘油2mL;100g・L-1 过硫酸铵400μL;蒸馏水25.5mL;TEMED40μL，混匀;③倒胶，插入加样梳，静置4～5h至胶凝结;④500V电压预电泳30min;⑤取PCR产物5μL，加5μL变性加样液，混匀;95℃变性5min，迅速置冰浴中骤冷，然后加样;⑥电泳.恒压550～600V，温度18～20℃，电泳时间视PCR产物大小而定.
　　
　　1.4 银染 ①电泳完毕后，将胶剥下，放入洁净的盆内，并切下一角作为标记;②固定液浸泡30min，以 蒸馏水冲洗3次;③加入染色液，染色5～10min，用蒸馏水清洗3次;④加入显色液，轻轻晃动，至带纹清晰为止;⑤加入终止液，以防过度显色;⑥拍照，保存.
　　1.5 双脱氧链终止法进行DNA序列测定
　　1.5.1 测序模板 PCR产物.
　　
　　1.5.2 测序反应 ①变性反应:a.在1.5mL离心管中准备变性反应混合液:测序模板3～5μL;2N NaOH3μL;加TE（pH8.0）至30μL;37℃保温30min.b.加入1/10体积3mol・L-1 NaAc（pH5.2），2～5倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30min以上.c.12000r・min-1 离心10min弃上清，加700mL・L-1 乙醇洗涤沉淀，空气干燥，溶于7μL ddH
2 O.②退火反应:a.在1.5mL离心管中准备退火反应混合液:变性模板7μL;5×Sequenase buffer2μL;primer（10mg・L-1 ）1μL.b.65℃保温2min，30min内使温度降至35℃以下，置于冰上备用.③标记反应:a.在1.5mL离心管中准备标记反应混合液:退火反应混合物10μL;0.1MDTT1μL;1×Labeling mix2μL;α-32 P-dATP0.5～1μL;测序酶（1∶7稀释）2μL.b.充分混匀，避免产生气泡，室温反应2～5min.④终止反应:a.在4个标有G，A，T，C的离心管中各加入2.5μL相应的ddNTP，37℃预热1min;b.各加入3.5μL标记反应混合物，稍离心，继续温育至3～5min;c.各加入4μL终止液，充分混匀，置于冰上;d.75～80℃热变性2min，立即置于冰上，准备上样电泳.
　　
　　1.5.3 序列胶电泳 ①配制60g・L-1 变性聚丙烯酰胺凝胶:400g・L-1 丙烯酰胺母液（19∶1）9mL;尿素30g;5×TBE12mL;加ddh3 O至60mL;加入350μL100mL・L-1 AP，30μL TEMED，充分混匀.灌胶.②35～45w预电泳30min;③每个泳道上样2～3μL，35～45w电泳约2.5h;第2次上样再电泳2.5h;④卸板，置于暗盒中，压X光片;⑤冲洗X光片，读序.
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 PCR┐SSCP┐银染法检测p53基因突变 利用PCR-SSCP结合银染法，对25例胃癌组织p53基因的第4、第5～6、第7外显子进行了突变检测，结果测得阳性标本5例，突变率为20%（Tab2）.其中1例标本，我们在进行PCR扩增时就发现该病例胃癌组织中p53基因第7外显子扩增片段明显小于其它病例，进行PCR-SSCP也证实这一结果（Fig1，2）.
　　
　　2.2 DNA测序结果 对上述第7外显子检出的阳性突变的胃癌组织及相应的癌旁组织以双脱氧链终止法进行DNA测序，发现该病例胃癌组织中p53基因第7外显子出现了18bp的大片段缺失，包括第247～252密码子（Tab3，Fig3）.
　　
　　表2 胃癌中p53基因突变检测结果　略 　　图1 － 图2 略
　　
　　表3 胃癌p53基因第7外显子的大片段缺失　略
　　
　　3 讨论
　　
　　PCR-SSCP是将双链DNA经变性后成为单链DNA，然后经非变性碱基凝胶电泳，从而分离单链DNA.单链DNA的泳动率不仅与DNA长度和分子量大小有关，也同DNA构型有关.DNA片段中即便是一个碱基的改变也足以影响DNA单链的构型，从而影响其泳动率.因此从泳动率的改变可以检测到基因突变.
　　
　　图3 略
　　
　　我们应用PCR-SSCP-银染法检测出25例胃癌中p53基因突变率为5/25.我们的结果表明在胃癌中p53基因突变主要集中在第5～6和第7外显子（分别为2/25），与国外报道相似.
　　
　　上述方法对于p53基因突变只能定性，即只要出现带型变化就可认为发生了突变.但要进一步了解突变的位置及涉及的碱基片段，还需通过DNA测序来确定.为此，我们对p53基因第7外显子阳性突变的标本进行了DNA测序，结果首次在中国人胃癌组织中发现p53基因18bp的大片段缺失，提示p53基因大片段缺失也是中国人胃癌病因学之一.虽然关于人类肿瘤中p53基因改变的报道很多，但从基因异常的形式来看，多数突变表现为单个碱基的改变，大片段的缺失尚未见报道.
　　由此可以得出结论:人类胃癌的发生伴随着p53基因的突变，其中包括大片段的缺失，因为该基因突变后影响了具有正常构象的野生型p53蛋白的表达而使其失去原有的抑癌功能，从而导致肿瘤的发生.这一结论对于人类其他肿瘤的发生也是同样适用的［6，7，13，14］ .
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