关键词: 磁刺激/经颅重复性;苍白球;黑质;酪氨酸羟化酶;免疫组织化学
摘 要:目的 观察经颅重复性磁刺激（rTMS）对大鼠苍白球（GP）和黑质（SN）酪氨酸羟化酶（TH）阳性细胞及纤维变化的影响. 方法 采用置于大鼠头部的磁刺激器，每日予以1Hz，100mT的磁刺激10min，1次・d-1 ，共14d，然后免疫组织化学ABC法检测苍白球及黑质等部位TH免疫阳性产物的表达. 结果 较之假刺激组动物，rTMS后大鼠GP的TH免疫阳性纤维明显增多，尤以苍白球外侧部（GPe）和腹侧苍白球（VGP）明显;两组动物黑质致密部（SNC）和网状部（SNR）TH阳性标记的细胞数目未见明显差别，但rTMS组动物SNR和黑质外侧部（SNL）的TH阳性纤维数量有所增加. 结论 rTMS能够调整作为基底神经节主要输出结构的GP特别是GPe和SNR的多巴胺水平，推测在帕金森病等的治疗上有着一定的意义.
Keywords:rTMS;globus pallidus;substantia nigra;TH;immunohistochemistry
Abstract:AIM To observe the effects of repetitive transcra-nial magnetic stimulation（rTMS）on tyrosine hydroxylase（TH）positive staining in rat globus pallibus and substantia nigra.METHODS Animals were treated with repetitive stimulation of1Hz，100mT electromagnetic field10minutes per day for14days，and then TH positive neurons and fibers in global pallidus（GP）and substantia nigra（SN）were de-tected immunohistochemically.RESULTS Compared with that in control group，high TH positive fibers were induced in the GP of experimental rats，especially in the external part of GP（GPe）and ventral globus pallidus（VGP）.No significant difference of the numbers of TH-positive cells in substantia nigra pars compacta（SNC）and pars reticulata（SNR）in both groups，but TH-positive fibers in SNR and lateral sub-stantia nigra（SNL）of rTMS group animals increased than that in sham stimulation group.CONCLUSION Dopamine levels in globus pallidus especially external pallidus and sub-stantia nigra pars reticulata that are main output nucleus of basal ganglia could be modulated by rTMS.We presume that it may play some role in treating neurological disorders such as Parkinson’s disease.
0 引言
尾、壳核及苍白球作为皮质-皮质下环路的重要组成部分，在对来自感觉运动皮质信息的调控和整和上起着相当的作用，参与了运动功能和许多行为活动的控制.帕金森病所表现出的运动减少、震颤及相伴随的抑郁等症状的出现与基底节结构或（和）神经介质改变有着密切的关系［1，2］ .经颅重复性磁刺激（rTMS）替代电刺激治疗抑郁症取得了良好效果，同时对于帕金森氏病及多发性硬化等疾病的原发和伴随症状甚至有着戏剧性的改善作用［3-6］ ，但其机制尚不明了，推测与rTMS后纹状体多巴胺含量的变化等因素有关［7］ .酪氨酸羟化酶（TH）的活力变化是多巴胺生物合成调控作用的中心环节，TH的磷酸化是增强酶活力的重要因素，细胞内则通过多种信号转导途经调节TH的磷酸化.
我们研究的目的在于观察大鼠rTMS对基底节主要输出结构 苍白球和黑质TH阳性细胞及纤维变化的影响，探讨rTMS对神经精神疾病治疗作用的神经生物学基础.
1 材料和方法
1.1 材料 采用实验初始时体质量200～225g的雄性SD大鼠16只，随机分为rTMS组（n=10）和对照组（n=6）.动物饲养与实验均遵照本校实验动物饲养与使用规定.
1.2 方法 将清醒实验动物置于长方形塑料器具中，头部暴露于一直径8cm的圆形磁刺激探头下，予以1Hz，100mT的磁刺激（磁刺激器，美国Magstim公司），10min，1次・d-1 ，共14d.对照组动物除不予磁刺激外，余处理方法同实验组动物.最后一次刺激2h后，ip戊巴比妥钠（40mg・kg-1 ）麻醉并经左心室依次灌入生理盐水100mL，40g・L-1 多聚甲醛液（溶于pH7.4，0.1mol・L-1 的磷酸缓冲液）500mL（1.5～2h），立即取脑并浸入200g・L-1 蔗糖液中过夜（4℃）.冰冻切30μm厚的纹状体冠状切片，每4张取一张，切片置于含有0.01mol・L-1 ，pH7.4磷酸盐缓冲液（KPBS）中，用ABC法进行免疫组化染色:将切片浸入兔抗TH血清（1∶5000，Inc-star;稀释于含有10g・L-1 小牛血清白蛋白，2.5g・L-1 Triton X-100和1g・L-1 叠氮钠的KPBS中）48h，随后依次进入生物素化抗兔IgG（1∶500，Sigma）和ABC（1∶500，Sigma）中室温下各孵育2h，继之用葡萄糖氧化酶-DAB-镍法将免疫产物显为黑色.在孵育过程中省略了一抗的空白对照切片上未发现免疫阳性标记的细胞或纤维.免疫组织化学染色后，将切片裱于明胶处理的载玻片上，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，D.P.X树胶封片.
2 结果
实验组动物在摄食、饮水、睡眠及体质量等方面与对照组动物无差别，磁刺激后未引出惊厥等异常.
2.1 苍白球 假刺激组动物的TH阳性纤维集中于未名质（SI）及靠近内囊（ic）的区域（Fig1），其中未名质的阳性纤维呈簇状分布（Fig3），内囊腹内侧区域的纤维则表现为线团样，而外侧苍白球（GPe）的TH阳性纤维散在稀疏分布（Fig5）.较之假刺激组，rTMS组动物的TH阳性纤维数目增多（Fig2），无名质（Fig4）特别是GPe的阳性纤维数目增多明显（Fig6），位于前联合（ac）腹侧的腹侧苍白球（VGP）亦表现出较对照组增多的TH阳性纤维（Fig7，8）.
2.2 黑质 rTMS组及对照组动物的黑质网状部（SNR）及致密部（SNC）均可见到阳性的TH细胞和 纤维，细胞多为梭形，TH纤维较粗大，但缺少分枝及终扣.两组动物SNR和SNC的细胞数目无明显差别，但rTMS组SNR的TH纤维数量较对照组略有增加（Fig9，10）.黑质外侧部（SNL）不同于SNR和SNC的TH纤维，表现为较细小而富有终扣，实验组比对照组的纤维数目亦有所增加（Fig11，12）. 3 讨论
rTMS作为一种无创安全的脑刺激手段，已广泛应用于皮层功能的研究［8］ .近年来rTMS在情感障碍性精神疾患上的治疗及对帕金森病等疾病症状的改善上所取得的令人满意效果，使人们对rTMS如何影响脑结构和功能产生了越来越多的兴趣.予以rTMS后前额叶β-肾上腺能受体明显上调，纹状体β-肾上腺能受体下调［9］ ;海马突触传递，特别是五羟色胺及去甲肾上腺素对突触活性的调节作用的研究发现，rTMS能长时程的降低中枢调控系统的效率［10］ .我们发现经过14d rTMS后，大鼠GPe和VGP的TH纤维数目较之假刺激组动物明显增多，而SNC及SNR的阳性细胞数目虽无明显差别，但SNR阳性标记的纤维却有所增加.
GPe是基底节局部环路的中心和理论上的执行部位，为间接通路的组成结构，GPe功能活性异常下降导致基底节靶区的过度抑制，从而出现运动减少［11］ .作为基底节输出核团的多巴胺水平的变化被认为在帕金森病运动障碍的发生上有着重要的作用.研究表明，帕金森病发生时，苍白球的多巴胺及其代谢产物高香草酸（HVA）水平明显下降，特别是GPe的多巴胺含量下降达82%［12］ .帕金森病时，苍白球内、外侧部γ-氨基丁酸（GABA）水平增加，这与失多巴胺能支配直接相关.电生理实验显示多巴胺能减缓GABA在苍白球的作用，而在大鼠苍白球局部应用多巴胺能药物可以减少或消除各种运动行为的异常表现.苍白球外侧部及其同源性结构腹侧苍白球还参与重要的整和功能，与抑郁症的发病有着一定的关系.黑质的网状部在形态及化学介质上与苍白球有着相似之处，为另一重要的基底节输出核团，帕金森病黑质网状部的多巴胺含量也明显下降.rTMS在治疗帕金森病等疾病上取得了满意的效果，而我们目前的实验结果表明，rTMS后能增加黑质的网状部及苍白球外侧部等基底节输出核团的TH纤维数量，提示这种治疗手段存在着一定的神经生物学基础.
图1 －图12 略
参考文献
［1］Afifi AK，Bergman RA.Functional neuroanatomy ［M］.Xi’an:World Books Publishing Company，1998:275-294.
［2］Gao GD，Zhang H，Zhang BG，Wang QF，He SM，Li YL，Hou F，Chen L，Zhao JB，Iacono RP，Li YJ.Application of micro-electrode recording in pallidotomy for treatment of Parkinson’s disease ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Uni），1998;19（2）:221-222.
［3］Triggs WJ，McCoy KJ，Greer R，Rossi F，Brower D，Ko-rtenkamp S，Nadeau SE，Heilman Km，Goodman WK.Effects of left frontal transcranial magnetic stimulation on depressed mood，cognition，and corticomotor threshold ［J］.Biol Psychia-try，1999;45（11）:1440-1446.
［4］Siebner HR，Mentschel C，Auer C，Conrad B.Repetitive tran-scranial magnetic stimulation has a beneficial effect on bradyki-nesia in Parkinson’s disease ［J］.Neuroreport，1999;10（3）:589-594.
［5］Richards TL，Lappin MS，Lawrie FW，Stegbauer KC.Bioelec-tromagnetic applications for multiple sclerosis ［J］.Phys Med Rehabil Clin N Am，1998;9（3）:659-674.
［6］Grafman J，Wassermann E.Transcranial magnetic stimulation can measure and modulate learning and memory ［J］.Neuropsy-chologia，1999;37（2）:159-167.
［7］Ben SD，Belmaker RH，Grisaru N，Klein E.Transcranial mag-netic stimulation induces alterations in brain monoamines ［J］.J Neural Transm，1997;104（2-3）:191-197.
［8］Hallett M.Transcranial magnetic stimulation and the human brain ［J］.Nature，2000;406（13）:147-150.
［9］Shachar BD，Gazawi H，Levin JR，Klein E.Chronic repetitive transcranial magnetic stimulation alters beta-adrenergic and5-HT2receptor characteristics in rat brain ［J］.Brain Res，1999;816（1）:78-83.
［10］Levkovitz Y，Marx J，Grisaru N，Segal M.Long-term effects of transcranial magnetic stimulation on hippocampal reactivity to afferent stimulation ［J］.J Neurosci，1999;19（8）:3198-3203.
［11］Wichmann T，Derlong MR.Functional and pathophysiological models of the basal ganglia ［J］.Curr Opin Neurobiol，1996;6（6）:751-758.
［12］Hornykiewicz O.Biochemical aspects of Parkinson’s disease ［J］.Neurology，1998;51（Suppl2）:s2-s9.转贴于