【关键词】 碱性成纤维细胞生长因子
关键词: 碱性成纤维细胞生长因子;硫糖铝;皮瓣;成活率
摘 要:目的 观察不同剂量碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和硫糖铝联合局部应用对兔背部任意皮瓣断蒂后成活率的影响，以判断bFGF和硫糖铝最佳有效使用剂量. 方法 以大体观察、计算机图像分析、荧光素钠试验、99 Tcm 放射核素测定、组织学和免疫组化等技术，测定断蒂后皮瓣的成活率，观察皮瓣血流灌注和血管新生情况. 结果 bFGF和硫糖铝联合局部应用可提高皮瓣成活率，皮瓣成活率与bFGF和硫糖铝的剂量明显相关:皮瓣成活率:A组对照组（24.2±8.2）%;B组bFGF125AU组（37.5±7.0）%;C组bFGF250AU组（65.5±7.1）%;D组bFGF500AU组（72.3±5.6）%;C组与D组间无显著差异（P&>0.05），其他各组间均有显著差异（P&<0.05）.说明bFGF达到125AU即有明显疗效，250AU效果最佳，超过一定剂量bFGF的作用就不再增加. 结论 皮瓣成活率与bFGF和硫糖铝的剂量明显相关.
Keywords:basic fibrobrast growth factor;sucralfate;skin flap;survival
Abstract:AIM To observe the effect of local application of different dosages of bFGF with sucralfate on the rabbit dorsal random skin flap survival rates and judge the comparatively effective dosage of bFGF with sucralfate.METHODS Im-age analysis of computer，fluorescein trail，assay of99 Tcm ，histology observation and immunohistochemistry technique were used to determinate the effects of different dosages of bFGF with sucralfate on the survival rates of the skin flaps and to investigate the blood perfusion and new blood vessels formation in the skin flaps.RESULTS The flap survival rate can be rised by means of local application of bFGF with sucralfate.The flap survival rates:Group A（Control）is（24.2±8.2）%;Group B（bFGF125AU）is（37.5±7.0）%;Group C（bFGF250AU）is（65.5±7.1）%;Group D（bFGF500AU）is（72.3±5.6）%;There is no signifi-cantly difference between Group C and Group D（P&>0.05）and is significantly diffrence between the other groups（P&<0.05）.It can be clarified that the bFGF’s effect is notable when the dosage is125AU and the effect is the best when the dosage is250AU.The effect of bFGF cannot be in-creased when its dosage is over certain level.CONCLUSION The flap survival rate is correlated with the dosage of the bFGF with sucralfate.
0 引言
带蒂皮瓣转移目前仍然是整形外科常用的组织修复方法之一［1，2］ ，该方法的缺点是皮瓣转移之后一般需要3wk左右方可以建立足够的血液循环，等待断蒂的时间比较长，如何促使皮瓣与基底部尽快建立血液循环是整形外科的重要研究课题［3］ .碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）具有促进新生血管形成的作用［4］ ，硫糖铝可以增强bFGF的生物学活性，保护其不被酸降解，延长与组织的作用时间［5，6］ .在应用bFGF和硫糖铝增加皮瓣成活面积的各类文献报道中，bFGF的用量不一，每个皮瓣1～1000AU，尚无统一的使用标准剂量.我们通过不同剂量的bFGF和硫糖铝联合局部应用于兔背部任意皮瓣，测量断蒂后皮瓣的不同成活面积和成活率，研究bFGF和硫糖铝的最佳有效剂量，并探讨bFGF的作用机制.
1 材料和方法
1.1 材料 健康3mo龄家兔（雌雄不限）12只，体质量2.5～3kg，由本校实验动物中心提供.bFGF由珠海东大制药有限公司提供（2.5×106 AU・L-1 ）;硫糖铝由东北制药厂提供（100mg・L-1 ）;100g・L-1 荧光素钠由本校西京医院药厂提供;免疫组化试剂:CD34 mAb及S-P试剂盒购自福州迈新免疫组化试剂公司;羊抗鼠二抗（Dako Envision试剂盒）购自Dako基因公司;PYP:上海红旗制药厂制造;99 Tcm O4- 由钼锝发生器淋洗获得，由中国核动力研究院西南反应堆提供;γ照相机:SPECT:Starcam3000型，由美国GE公司制造.
1.2 方法 脊柱两侧设计蒂在髂嵴连线上的任意皮瓣各1块，面积3cm×6cm，皮瓣间隔4cm，按用药剂量不同分为3个实验组和1个对照组:A组为生理盐水1mL;B组为bFGF125AU（0.05mL）+硫糖铝1mL;C组为bFGF250AU（0.1mL）+硫糖铝1mL;D组为bFGF500AU（0.2mL）+硫糖铝1mL，各组皮瓣均为6块.术前3d兔背部以100g・L-1 硫化钠脱毛，用30g・L-1 戊巴比妥钠以33mg・kg-1 ，ip，麻醉，动物取俯卧位，碘酒乙醇消毒，铺无菌巾，按设计线切开皮肤、皮下组织、肉膜，在肌膜浅面剥离，掀起皮瓣，受床放置1条直径1mm的硬膜外麻醉导管（带侧孔），固定导管，皮瓣原位缝合.从导管注射药物，每次注射时间5min（3滴・min-1 ），2次・d-1 ，用药3d.术后4d各组动物行皮瓣断蒂术，断蒂后7d测量皮瓣成活面积，计算成活率.以成活面积/皮瓣总面积×100%为成活率.
1.2.1 荧光素钠试验 断蒂后15min100g・L-1 荧光素钠15mg・kg-1 ，iv，15min后进行荧光摄影.
1.2.2 放射核素试验 断蒂后7d各组家兔用PYP1/10支，iv，30min后99 Tcm 55.5MBq标记红细胞，iv，1h后处死动物，按设计面积及厚度切下双侧皮瓣，立即在γ照相机下测定γ计数并行ECT照相.
1.2.3 组织学检查 术后2，3和4d各组皮瓣取活检0.5cm×0.2cm，40g・L-1 甲醛固定，进行HE和CD34 免疫组化染色，光镜下观察皮瓣毛细血管生长情况并计数.血管计数方法:所有血管均计数在内，每组6张切片，每张切片在中央区及周边区随机选取5个高倍视野，血管计数后求其平均数.在免疫组化染色片中，凡与周围结缔组织成分分离的染成棕色的单个内皮细胞或内皮细胞簇被认为是一个微血管.
统计学处理:数据用本校卫生统计学教研室的SPLM3.0软件进行分析处理，组间差异检验用单因素方差分析及其两两比较，数据用x ±s表示.当P&<0.05时认为有统计学的显著性差异.
2 结果
2.1 皮瓣的成活率 D组（72.3±5.6）%&>C组 （65.5±7.1）%&>B组（37.5±7.0）%&>A组（24.2±8.2）%;C组与D组间无显著差异（P&>0.05），其他各组间均有显著差异（P&<0.05）.
2.2 放射核素试验 每克组织放射性计数为，D组（1296±76）・min-1 &>C组（1244±77）・min-1 &>B组（616±95）・min-1 &>A组（504±105）・min-1 .C组与D组间无显著差异（P&>0.05），其他各组间均有显著差异（P&<0.05）.因为99 Tcm O4- 已经标记在红细胞上，在全身血液循环系统中达到平衡，所以放射性计数的高低可以代表皮肤局部血流灌注的多少.bFGF&>125AU可明显提高皮瓣的成活率和血流灌注，250和500AU疗效较125AU明显，250和500AU间无明显差异，说明bFGF和硫糖铝合用能促进皮瓣尽快建立血液循环，提高皮瓣成活率，bFGF达到125AU即具有明显的效果，250AU效果最佳;bFGF的疗效与其剂量大小明显相关;但bFGF超过一定剂量后即使增加剂量也不能进一步提高其效果.
2.3 荧光素钠试验 各组皮瓣荧光显色范围比皮瓣实际成活面积稍小但基本一致，证实荧光素钠判断皮瓣血循环建立情况是比较准确的，可作为皮瓣断蒂前的辅助指标［7］ .
表1 各组皮瓣血管计数 略
2.4 组织学检查 HE染色光镜下见术后2d，A，B组血管内皮细胞数少;C，D组血管内皮细胞数轻度增加;术后3d，A组血管内皮细胞数无明显变化，B组轻度增加;C，D组血管内皮细胞数中度增加;术后4d，A组血管内皮细胞数轻度增加，B组呈中度增加，C，D组呈明显增加（Tab1）.免疫组化染色显色较好，血管内皮细胞胞质染成棕黄色，血管增生情况和血管计数与HE染色相符，统计分析结果与HE染色相同;说明HE染色和CD34 免疫组化染色有极好的相关性.
3 讨论
我们研究结果表明，bFGF和硫糖铝联合局部应用可促进皮瓣与创基间血管新生和血流灌注，提高皮瓣成活率;皮瓣成活率与bFGF和硫糖铝的剂量明显相关，bFGF达到125AU即有明显疗效，250AU效果最佳，但bFGF超过一定剂量后即使增加剂量也不能进一步提高其效果.bFGF是一种多功能的细胞生长因子，作用于机体内所有组织细胞，其中包括内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞等，它刺激靶细胞增加DNA的合成，对这些细胞有促丝裂原作用和趋化作用，实现其靶细胞的快速增殖分化;它诱导上皮细胞分泌纤维蛋白酶和胶原蛋白酶并增加其活性，穿过细胞外基质使毛细血管内皮细胞分裂，增殖，形成新的血管腔，增加细胞外基质沉积和新血管数量，在创伤修复中起重要作用;局部用药未见全身吸收现象，静脉和局部大剂量用药也未见任何毒副作用［8］ ;bFGF的作用机制主要是通过促分裂效应和非促分裂激素样活性而起作用.
bFGF和硫糖铝联合应用发挥协同作用是近年才被发现的.Folkman等［4］ 在兔角膜中植入bFGF和硫糖铝混合的药丸，角膜新生血管的出现比单用硫糖铝早，血管总长度比单用硫糖铝长2.8倍，且局部无炎症反应，证明了bFGF和硫糖铝复合物是所有非炎症性促血管增生药物在角膜上作用最强时效最久的一种.bFGF和硫糖铝联合应用于皮瓣的国内外文献报道甚少，Duffy等［5］ 用bFGF+硫糖铝局部应用于兔耳预构皮瓣，成活率较对照组明显升高;Rashid等［6］ 用bFGF+硫糖铝局部应用于大鼠背部皮瓣，联合用药组较bFGF单用组皮瓣成活率更高，
外源性bFGF和硫糖铝合用能促进皮瓣新生血管化， 维持皮瓣的血循环，防止早期缺血;且RT-PCR检测结果显示各组内源性bFGF mRNA表达无差异，提示皮瓣急性期促血管生成作用是外源性bFGF作用的结果.但是，应用bFGF和硫糖铝促进带蒂皮瓣尽快建立血运的文献报道甚少.
bFGF和硫糖铝提高兔背部任意皮瓣断蒂后的成活率，除了其早期促血管生成作用外，还能减少断蒂后皮瓣缺血的损伤.有人认为血管增殖初期的内皮细胞需要一定量的bFGF激发，而激发后就不再需要这种有效浓度的维持，这解释了有些实验报道的单剂量bFGF的促血管生成作用;bFGF是和创面局部其靶细胞膜上的特异性受体结合而起作用的，当受体被结合达到饱和时，超量的bFGF就不起作用，这也许是bFGF增量而成活率不增加的原理;曾有bFGF10μg（1mL）+硫糖铝1000μg（1mL）使大鼠皮瓣成活率下降而bFGF1μg（1mL）+硫糖铝100μg（1mL）使成活率明显提高的报道［6］ ，这可能是生长因子间对受体的竟争作用反而使疗效降低之故.bFGF和硫糖铝合用能促进皮瓣与受床间血管生成和血循环建立，使皮瓣血管数明显增加，250AU，500AU组较125AU组血管数增加更明显，但500AU组较250AU组并无剂量优势.同时，bFGF和硫糖铝剂量不同，促进血管新生的时序也不同.
我们的实验是为了合理使用bFGF和硫糖铝剂量，并探索bFGF的作用机制，在用药物促进皮瓣尽快建立血液循环、增加皮瓣成活率方面有一定的临床意义.bFGF的作用机制、bFGF和硫糖铝之间的使用比例关系、不同情况下bFGF和硫糖铝的有效剂量等，需要进一步深入研究.
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