作者：郭启煜 高妍 丛琳 邵宁生
【关键词】 脂肪酸类
关键词:脂肪酸类;瘦素受体;肌，骨骼/细胞学
摘 要:目的 探讨游离脂肪酸是否会对大鼠骨骼肌细胞Leptin受体的基因、蛋白表达及酪氨酸磷酸化产生一定的影响，进而导致胰岛素抵抗及葡萄糖代谢的异常. 方法 分离、培养新生Sprague-Dawley大鼠骨骼肌细胞，分别与软脂酸（0.25mmol・L-1 ）或油酸（0.125mmol・L-1 ）孵育12，24和36h，提取蛋白后用Western印迹法检测Leptin受体的蛋白水平.用RT-PCR检测胰岛细胞内Leptin受体RNA含量的变化.应用免疫沉淀法检测Leptin受体的酪氨酸磷酸化程度. 结果 软脂酸和油酸孵育后大鼠骨骼肌细胞Leptin受体的蛋白表达水平在孵育12和24h后同对照组相比无显著变化，在孵育36h后同对照组相比显著下调［软脂酸（0.36±0.03）和油酸（0.35±0.04）vs对照（0.39±0.05），P&<0.05］;Leptin受体的RNA水平在孵育12h后同对照组相比无显著变化，孵育24和36h后显著下调［24h:软脂酸（0.26±0.03）和油酸（0.26±0.04）vs对照（0.31±0.03），P&<0.05;36h:软脂酸（0.25±0.04）和油酸（0.23±0.03）vs对照（0.29±0.01），P&<0.05］;Leptin受体的酪氨酸磷酸化程度在在孵育12h后同对照组相比无显著变化，孵育24和36h后显著下调［24h:软脂酸（0.17±0.05）和油酸（0.15±0.06）vs对照（0.21±0.07），P&<0.05;36h:软脂酸（0.15±0.04）和油酸（0.13±0.04）vs对照（0.24±0.06），P&<0.05］. 结论 游离脂肪酸可对大鼠骨骼肌Leptin受体的基因及蛋白表达水平以及磷酸化程度产生一定的抑制作用，从而进一步引起胰岛素抵抗.
Keywords:fatty acids;leptin receptors;muscle，skeletal/cy-tology
Abstract:AIM To investigate effect of free fatty acid on gene and protein expression and tyrosine phosphorylation of leptin receptor in rat skeletal muscle cells.METHODS Skeletal muscle cells were isolated from new born Sprague-Dawley rats.After rat skeletal muscle cells were incubated with palmitate（0.25mmol・L-1 ）or oleate（0.125mmol・L-1 ）for12h，24h and36h，Western bolt was used to as-sess the protein abundance of Leptin-receptor in rat skeletal muscle cells.The RNA expression level of Leptin-receptor was revealed by RT-PCR.The tyrosine phosphorylation of Leptin-receptor was revealed by immuno-precipitation.RE┐SULTS After being incubated with free fatty acids（palmi-tate and oleate）for12and24h，there was no difference of the protein content of leptin receptor among rat skeletal mus-cle cells treated by palmitate and oleate and control cells（P&>0.05）.The protein abundance of leptin receptor in rat skeletal muscle cells significantly decreased compared with control after incubated with palmitate and oleate for36h ［palmitate（0.36±0.03）and oleate（0.35±0.04）vs control（0.39±0.05），P&<0.05］.The RNA contents of leptin re-ceptor in rat skeletal muscle cells were similar to control after being incubated with palmitate and oleate for12h（P&>0.05），but significantly decreased after24or36h ［24h:palmitate（0.26±0.03）and oleate（0.26±0.04）vs control（0.31±0.03），P&<0.05;36h:palmitate（0.25±0.04）and oleate（0.23±0.03）vs control（0.29±0.01），P&<0.05］.The tyrosine phosphorylation of Leptin-receptor remarkably reduced after being incubated with palmitate and oleate for24or36h ［24h:palmitate（0.17±0.05）and oleate（0.15±0.06）vs control（0.21±0.07），P&<0.05;36h:palmitate（0.15±0.04）and oleate（0.13±0.04）vs control（0.24±0.06），P&<0.05］.CONCLUSION Free fatty acids（palmi-tate and oleate）may down-regulate leptin receptor gene ex-pression and suppress its tyrosine phosphorylation in rat skeletal muscle cells and may contribute to the occurrence of insulin resistance through inhibiting glucose metabolism and insulin action.
0 引言
肥胖是一种常见的内分泌代谢疾病，发病率逐年上升，根据1998年WHO报告，肥胖已成为全世界最常见的流行病［1］ .肥胖与胰岛素抵抗和糖尿病的发生发展密切相关［2，3］ .肥胖者很容易产生高游离脂肪酸血症，而血浆游离脂肪酸过高是引起胰岛素抵抗的因素之一［4，5］ .但对游离脂肪酸是如何引起胰岛素抵抗的机制目前尚无定论.瘦素（leptin）是肥胖基因（obesity gene，OB）编码的蛋白质，具有调节机体能量代谢的作用
［6］ .有研究表明，脂肪组织分泌的瘦素可能是引起胰岛素抵抗的机制之一［7］ .有研究表明瘦素受体（OB-R，Leptin receptor）与胰岛素下游的信号转导通路存在“对话（cross talk）”.我们研究游离脂肪酸对大鼠骨骼肌细胞瘦素受体的影响，探讨肥胖导致胰岛素抵抗的可能机制.
1 材料和方法
1.1 材料 新生3～6d Spraque-Dawley（SD）大鼠.由北京大学医学部实验动物中心提供.软脂酸、油酸、胶原酶和胰蛋白酶为美国Sigma产品.DMEM培养基购自美国GIBCO公司;胎牛血清为中国医学科学院血液研究所产品;ECL化学发光试剂盒为英国Amersham公司产品.游离脂肪酸灌注液的配制:前述脂肪酸储备液与生理盐水混合，体积比例为1∶10，同时加入肝素10μL（100U・L-1 ）.
1.2 方法 处死新生Spraque-Dawley大鼠，取后肢股四头肌，剪碎后用胶原酶和胰蛋白酶消化，收集细胞.用含100mL・L-1 胎牛血清的199细胞培养基，37℃培养.待细胞生长并融合时，分别加入含软脂酸（0.25mmol・L-1 ）或油酸（0.125mmol・L-1 ）的199培养液，分别培养12，24和36h.同时设立空白对照.裂解细胞后提取蛋白，用BioRad微量蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度.
1.2.1 Western印迹法检测骨骼肌细胞Leptin受体的蛋白水平 取各样本50μg蛋白质进行SDS- PAGE电泳分离蛋白，电转移法将蛋白转移至PVDF膜，封闭后分别加入一抗（K-20，购自美国Santa Cruz）孵育;洗膜后加入HRP标记的二抗孵育.充分洗涤后与ECL（增强化学发光剂、购自英国Amer-sham）反应，即刻与Kadak X-Omat底片曝光，洗片后用Leica Q550-IW图像分析仪（德国）进行扫描，测定光密度（A），进行定量分析.
1.2.2 RT-PCR检测骨骼肌细胞的Leptin受体RNA水平 提取骨骼肌细胞总RNA.取RNA1μg进行逆转录反应，形成cDNA，再进行聚合酶联反应（PCR）.条件为:95℃预变性5min;95℃1min，55℃45s，72℃50s，共30循环，最后72℃延伸10min.引物由北京赛百盛生物工程公司合成.引物序列为:肥胖蛋白受体（OB-R）:5’-GCG GAT CCG GAA TGA GCA AGG TCA AAA C-3’，5’-CGT CTA GAG TGA CTT CCA TAC GCA AAC C-3’;扩增片断长度为477bp.内对照β-actin:5’-GAA TTC ATG TTT GAG ACC TTC AA-3’，5’-CC GGA TCC ATC TCT TGC TCG AAG TCC A-3’;扩增片断为326bp.取5μL PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳缓冲液为1X TBE.对瘦素受体和内对照β-actin扩增条带进行扫描分析，计算光密度（A）.根据OB-R（A）/β-actin（A）的比值，对瘦素受体的RNA表达水平进行半定量分析.
1.2.3 用免疫沉淀法检测Leptin受体的酪氨酸磷酸化程度 蛋白的提取同Western蛋白印迹法.免疫沉淀的基本流程:取提取的组织蛋白样品500μg，加入抗OB-R抗体10μL，4℃轻摇2h，加入蛋白A-琼脂糖20μL，4℃轻摇过夜.4℃1000g离心，弃上清.PBS1mL悬浮沉淀，4℃1000g离心5min，洗涤沉淀.重复3次.4℃1000g离心，弃上清，留沉淀.上样缓冲液加入沉淀，煮沸5min，离心后上样，进行SDS-PAGE电泳.电泳分离蛋白同Western blotting，转膜方法和条件同前，封闭，封闭液为含50g・L-1 卵清蛋白的TTBS缓冲液，室温轻摇1h.加入抗磷酸酪氨酸抗体，用TBS缓冲液稀释抗磷酸酪氨酸抗体（1∶500），将膜和适量的抗体稀释液放入杂交袋，4℃轻摇过夜.洗膜同前，加入二抗，洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶10000），与膜室温孵育1h.ECL增强发光，曝光同前.
统计学处理:实验数据用x ±s表示，组间显著性差异采用t检验.
2 结果
2.1 游离脂肪酸对大鼠骨骼肌细胞Leptin受体蛋白水平的影响 Western印迹法检测显示，在Mr120000处可见瘦素受体的杂交条带.经软脂酸和油酸作用12，24h后，骨骼肌细胞Leptin受体蛋白量与同期对照组相比无显著变化（P&>0.05）.经软脂酸和油酸作用36h后，骨骼肌细胞Leptin受体蛋白量与同期对照组相比及与同组16h相比显著下降（P&<0.05）.由数据分析可发现，随着孵育时间的延长，骨骼肌细胞Leptin受体蛋白水平持续下降（Tab1）.
表1 游离脂肪酸对大鼠骨骼肌细胞Leptin受体蛋白水平的影响 略
2.2 游离脂肪酸对大鼠骨骼肌细胞Leptin受体RNA含量的影响 根据RT-PCR结果分析，经软脂酸和油酸孵育12h后，骨骼肌细胞Leptin受体RNA含量与同期对照组相比无显著下降（P&>0.05）;经软脂酸和油酸孵育24及36h后，骨骼肌细胞Leptin受体RNA含量显著下降（P&<0.05）;且随时间延长，有继续下降的趋势（Tab2）.
2.3 游离脂肪酸对大鼠骨骼肌细胞中瘦素受体酪氨酸磷酸化免疫沉淀的检测结果 经软脂酸和油酸孵育12h后，骨骼肌细胞Leptin受体酪氨酸磷酸化程度与同期对照组相比无显著下降（P&>0.05）;经软脂 酸和油酸孵育24及36h后，骨骼肌细胞Leptin受体酪氨酸磷酸化程度对照组相比显著下降（P&<0.05）;且随时间延长，有继续下降的趋势.瘦素受体的酪氨酸磷酸化程度显著降低，提示游离脂肪酸抑制了大鼠骨骼肌细胞瘦素受体的酪氨酸激酶活性（Tab3）.
表3 游离脂肪酸对大鼠骨骼肌细胞瘦素受体酪氨酸磷酸化的影响 略
3 讨论
肥胖是Ⅱ型糖尿病非常重要的危险因素［8，9］ ，肥胖患者普遍存在着脂代谢异常，其脂肪分解速率和血浆游离脂肪酸都是增高的，血浆游离脂肪酸（FFA）是联系肥胖和胰岛素抵抗或高胰岛素血症的一个重要环节［10-12］ .瘦素（Leptin）是由1994年首次克隆到的肥胖基因（obesity gene，ob gene［13］ ，位于人类染色体7q32）编码的一种由167个氨基酸组成的分泌型蛋白质［14］ ，是一种脂肪组织源激素，具有广泛的生物效应.瘦素受体基因又叫糖尿病基因（diabetes gene，db），是Leptin的高亲和力受体，瘦素通过与瘦素受体的结合而影响着机体许多生理系统和代谢通路，在控制体脂、能量平衡等方面发挥作用［15］ .Leptin受体属于Ⅰ类细胞因子受体超家族，一方面可通过JAK/STAT蛋白发挥作用，受体胞内区（ICD）发生磷酸化，磷酸化的ICD提供了STAT蛋白的结合位点，结合磷酸化受体ICD后STAT蛋白被激活，激活后的STAT蛋白移入核内，刺激胰岛素的转录;另一方面，又可通过有丝分裂原活化蛋白（mitogen-activated protein，MAP）和磷脂酰肌醇3激酶（phos-phatidylinositol3-kinase）途径调控能量代谢和体质量平衡.许多研究发现胰岛素与Leptin存在着相互作用［16］ .Leptin水平的降低，并不仅仅因为体质量的下降.胰岛素刺激Leptin分泌，Leptin也通过胰岛细胞上的受体来抑制胰岛素的分泌，在胰岛素和Leptin之间存在着一个双向的反馈环.瘦素与胰岛素抵抗之间有密切关系［17，18］ .本结果表明，软脂酸和油酸孵育后大鼠骨骼肌细胞Leptin受体的蛋白表达水平在孵育12和24h后同对照组相比未发生显著变化，但在孵育36h后同对照组相比显著下调;Leptin受体的RNA水平在孵育12h后同对照组相比无显著变化，孵育24和36h后显著下调，说明短时间的高游离脂肪酸水平尚未对大鼠骨骼肌细胞中的Leptin受体的蛋白表达水平和基因表达水平造成显著影响，但如果延长对高水平的游离脂肪酸的暴露时间，则会对Leptin受体的蛋白表达水平和基因表达水平造成显著影响.Leptin受体的酪氨酸磷酸化程度在孵育12h后同对照组相比无显著变化，孵育24和36h后显著下调.结果表明，高游离脂肪酸孵育24h虽然未对Leptin受体的基因及蛋白表达造成显著影响，但却降低了Leptin受体的酪氨酸磷酸化程度，这提示游离脂肪酸首先抑制了大鼠骨骼肌细胞Leptin受体的酪氨酸激酶活性，这必然会对Leptin的信号传导造成一定的抑制作用.随暴露时间的延长，先对Leptin受体的基因表达水平造成抑制，然后对Leptin受体的蛋白表达水平造成抑制.高游离脂肪酸对Leptin受体作用的机制尚不清楚.游离脂肪酸对大鼠骨骼肌细胞Leptin受体基因及蛋白表达及酪氨酸磷酸化所产生的抑制作用，也许意味着游离脂肪酸与Leptin之间通过Leptin受体存在着一定的相互协调机制.但游离脂肪酸是否可通过对Leptin受体的作用，从而影响Leptin的生理作用，改变机体的能量代谢需进一步深入研究.
参考文献:
［1］Bjomtorp P.Obesity:A chronic disease with alarming preva-lence and consequences ［J］.J Int Med，1998;244（2）:267-269.
［2］Ford ES，Williamson DF，Liu S.Weight changes and diabetes incidence:Findings from a national cohort of US adults ［J］.Am J Epidemiol，1997;146（1）:214-222.
［3］Kohrt WM，Kirwan JP，Staten MA.Insulin resistance in aging is related to abdominal obesity ［J］.Diabetes，1993;42（2）:273-281.
［4］Hennes MI，Dua A，Kissehah AH.Effects of free fatty acids and glucose on splanchnic insulin dynamics ［J］.Diabetes，1997;46（1）:57-62.
［5］Hino Y，Ogawa W，Kasuga M.Insulin signalling system and mechanism of insulin resistance ［J］.Nippon Rinsho，2000;58（2）:297-303.
［6］Halaas JL，Gajiwala KS，Maffei M.Weight-reducing effects of the plasma protein encoded by the obese gene ［J］.Science，1995;269:543-546.
［7］Donahue RP，Prineas RJ，Donahue RD.Is fasting leptin associ-ated with insulin resistance among nondiabetic inpiduals ［J］?Diabetes Care，1999;22（4）:1092-1096.
［8］Leong KS，Wilding JP.Obesity and diabetes ［J］.Baillieres Clin Endocrinol Metab，1999;13（2）:221-237.
［9］Torres SH.Obesity，insulin resistance and skeletal muscle char-acteristics ［J］.Acta Cient Venez，1999;50（1）:34-41.
［10］Boden G.Role of fatty acids in the pathogenesis of insulin resis-tance and NIDDM ［J］.Diabetes，1997;46（1）:3-10.
［11］Manco M，Mingrone G，Greco AV.Insulin resistance directly correlates with increased saturated fatty acids in skeletal muscle triglycerides ［J］.Metabolism，2000;49（2）:220-224.
［12］Baldeweg SE，Golay A，Natali A.Insulin resistance，lipid and fatty acid concentration in867health europeans.European group for the study of insulin resistance（EGIR）［J］.Eur J Clin Invest，2000;30（1）:45-52.
［13］Zhang YY，Proenca R，Maffei M.Relational cloning of the mouse obese gene and its human homologo ［J］.Nature.1994;372（2）:425-432.
［14］Comuzzie AG，ALLison DB.The search for human obesity genes ［J］.Science，1998;280（5368）:1374-1377.
［15］Miczke A，Pupek MD.Leptin and obesity ［J］.Pol Merkuriusz Lek，2000;8（44）:109-112.
［16］Szanto I，Kahn CR.Selective interaction between leptin and in-sulin signaling pathways in a hepatic cell line ［J］.Proc Natl A-cad USA，2000;97（5）:2355-2360.
［17］Shintani M，Ogawa Y，Nakao K.Insulin resistance，role of lep-tin and leptin receptor ［J］.Nippon Rinsho，2000;58（2）:327-332.
［18］Girard J.Is leptin the link between obesity and insulin resistance ［J］.Diabetes Metab，1997;23（3）:16-24.