作者：雷建军，海春旭，曹云新
【关键词】 ，过氧化氢
关键词: 过氧化氢;白血病，早幼粒细胞，急性;细胞周期
摘 要:目的 探讨低浓度h3 O2 对同步化处理或未经处理的HL-60细胞作用的时间效应关系. 方法 将培养的HL-60细胞进行同步化处理或取对数生长期细胞，施加不同浓度梯度的h3 O
2 影响，作细胞计数，四唑盐（MTT）比色试验检测细胞生存率，流式细胞技术测定细胞周期分布. 结果 低浓度h3 O2 作用组HL-60活细胞数明显高于未施加影响组，尤以h3 O2 终浓度为2μmol L-1 组作用明显（P&<0.01），细胞周期也有轻度改变. 结论 低浓度h3 O2 作用HL-60细胞可使细胞数增加，其影响有时间效应关系，机制可能同其影响细胞周期有关.
Keywords:hydrogen peroxide;leukemia，promyelocylic，a-cute;cell cycle
Abstract:AIM To investigate the effects of hydrogen per-oxide on human leukemic cells（HL-60）in vitro，and illus-trate its possible mechanism.METHODS Cultivated HL-60cells of synchronization or non-synchronization were affected by different concentration of hydrogen peroxide.Then the number of living cells was recorded and the vitality of HL-60cells was measured by MTT methods.Cell cycle distribution was analyzed by DNA flow cytometry.RESULTS Com-pared with the control group，the number of HL-60cells af-fected by low concentration of hydrogen peroxide was increased.The effect on the Group of2μmol L-1 was espe-cially remarkable.The cell cycle changed slightly.CONCLU┐SION Low concentration of hydrogen peroxide could in-crease the number of HL-60living cells.Its main mechanism might probably be involved in the change of the cell cycle.
0 引言
关于自由基、活性氧对机体损害的机制一直是研究热点.自从1981年美国学者Larry W.Obeley［1］ 提出假设:“活性氧含量高低具有调控细胞分化或分裂作用，主要同染色体氧化损伤有一定的关系”后，许多学者对此做过一定的研究工作，发现机体中自由基含量和自由基反应启动速率变化都可控制与细胞增殖有关的代谢过程［2-4］ .国内关于自由基的研究多集中在其损伤作用、引发凋亡、组织中含量测定及其清除剂方面，在低浓度活性氧介质对经同步化处理或未处理细胞的影响方面报道很少.本试验以不同浓度梯度的h3 O2 作用人早幼粒细胞HL-60，探讨其对活细胞的影响及其机制.
1 材料和方法
1.1 材料
人白血病HL-60细胞系由第四军医大学西京医院血液科实验室惠赠.过氧化氢（h3 O
2 ）西安试剂厂产，-4℃避光保存.临用前以三蒸水稀释成所需浓度，试验组加入不同浓度梯度的h3 O2 溶液（简称h3 O2 组），对照组加入等体积三蒸水.台盼蓝、4-硝基唑蓝（MTT）购自华美生物有限公司.
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
HL-60细胞常规培养，培养液为含100mL L-1 小牛血清，青、链霉素各1×105 u L-1 的RPMI-1640，隔天换液.
1.2.2 细胞计数测细胞存活率
取对数生长期细胞，置4℃冰箱4h，使细胞低温同步化后取出，立即施加不同浓度梯度的H 2 O 2 溶液，浓度范围0.1μmol L-1 至10mmol L-1 ，设阴性对照，37℃温育.取处理后不同时间点终止培养，4g L-1 台盼蓝溶液染色，计数活细胞和细胞总数.
1.2.3 四唑盐（MTT）比色法检测细胞活力
取对数生长期细胞，调整细胞密度为5×10 5 mL-1 ，以每孔0.2mL接种96孔板，共五板，37℃，50mL L
-1 CO
2 孵育.次日晨每板分12个组，每组8个平行孔，按不同终浓度分别加入H
2 O
2 溶液，浓度梯度如下:0.01，0.1，1，2，5，10，20，50，100，1000μmol L-1 ，无h3 O2 组，单纯培养基组.五块板分别于0，1，2，3，4d取出，加5g L-1 MTT溶液20μL/孔，37℃温育4h后吸取上清，加二甲基亚砜（EMSO分析纯）150μL，震荡10min，使紫色结晶物充分溶解，用酶联免疫计数仪，波长为490nm，测定各孔吸光度.
1.2.4 细胞周期DNA分布测定
取对数生长期细胞，无血清培养液培养24h使细胞同步化，离心去除无血清培养基，加入含100mL L-1 小牛血清的1640培养基，稀释细胞密度为5×105 mL-1 ，分别加入12孔板，每孔容积为2mL.取6孔各施加终浓度为2μmol L-1 的h3 O2 溶液，另6孔各加入等体积三蒸水.37℃，50mL L-1 CO2 孵育，于不同时间点（0，2，6，12，18，24h）同时取施加影响组和阴性对照组各一孔细胞，置两只离心管中以800r min-1 离心5min，PBS洗两次，弃上清，700mL L-1 乙醇固定，4℃存放待测.测定时离心去上清，PBS洗涤2次，加入碘化丙啶，避光染色15min，FACSPLUS流式细胞仪进行细胞周期测定.
2 结果
2.1 细胞计数
低浓度剂量h3 O2 （1μmol L-1 ）作用HL-60细胞后，光镜下观察见细胞外形规则，边缘光滑，折光性好，死亡细胞很少，增殖活跃，活细胞数明显较空白对照组多;中等浓度剂量h3 O2 （100μmol L-1 ）作用HL-60细胞后，3h可见少许变形细胞，外形不规则，有长条形状，细胞轮廓尚在，可见一些细胞碎片，12h活细胞数降至最低点，后开始逐渐恢复;高浓度剂量h3 O2 （5mmol L-1 ）作用HL-60细胞后，细胞大量死亡，胞膜不完整，仅见细胞轮廓，出现大量细胞碎片，台盼蓝溶液染色见细胞均为蓝染，12h后细胞全部死亡.72h后三组活细胞数均开始下降（Fig1）.在此基础上进一步做MTT比色试验.
2.2 TT比色法结果
低浓度h3 O2 组（2μmol L-1 ）活细胞数明显高于未施加影响组，连续4d采样测MTT值，统计分析有显著性差异（P&<0.01）.中浓度组（20μmol L-1 ）细胞在施加影响后1d即低于正
常组，连续培养4d，细胞数有明显上升，同未施加影 响祝比较，统计处理无显著性差异（P&>0.01），高浓度剂量h3 O2 组（1mmol L-1 ）细胞完全死亡.本实验共分10个组别，取统计结果最为明显的3组作图（Fig2）.
2.3 细胞周期中DNA分布测定结果
细胞经同步化后，低浓度h3 O2 组（2μmol L-1 ）细胞和未施加影响组细胞同时同条件采样，经流式细胞仪分析（Tab1）.h3 O2 作用2h后G2 期细胞数高于对照组，且G1 期细胞数高于0h正常组，表明H 2 O2 作用组未经同步化细胞有可能由G2 期较快进入G1 期;h3 O2 作用6h后G
1 期细胞数低于对照组，表明h3 O 2 作用组G1 期细胞较快进入S期;12h后两组细胞逐渐趋向一致. 表1 细胞周期测定结果（略）
3 讨论
自由基在细胞增殖分化过程中发挥的作用，以引发凋亡研究较多［6，7］ ，国外对自由基影响细胞分化，分裂的研究工作已取得很大进展.Forrest等［8］ 用0.5～10μmol L-1 的h3 O2 处理鼠胸腺细胞10min，可诱导胸腺细胞出现胞质和核染色质浓缩这一典型的凋亡现象，且随着H
2 O2 剂量的增加，DNA片段的百分比也增加，在含溴化乙锭的琼脂凝胶电泳上呈现典型的”条带，表现出浓度相关性.也有一些学者对过氧化物自由基作用DNA的机制［9］ ，引起机体病理［10］ 生理［11］ 变化的机制做了一些探讨.国内对自由基，尤其是过氧化氢的研究多集中在其对机体的损伤作用上.
本实验组在以往的实验过程中，发现过氧化物自由基对细胞的作用存在一个剂量效应和时间效应关系，高剂量有直接杀伤作用，中剂量可引发凋亡，低剂量对细胞有保护作用［12］ .HL-60细胞体外增殖活跃，是很好的检测药物刺激细胞增殖的细胞模型［13］ .本实验从细胞计数，光镜观察，MTT比色实验验证过氧化氢对细胞增殖的作用，每一实验均经两次重复.发现低浓度H
2 O2 组（2μmol L-1 ）对HL-60细胞的活细胞数影响最大，一般情况下，活细胞数的增多多为刺激细胞增殖所致，本试验经流式细胞仪分析，低剂量过氧化氢组细胞周期进程轻微改变，考虑过氧化氢增加细胞数可能为影响细胞周期所致，亦可能有其它机制发挥作用.其作用机理有待进一步探讨.
参考文献
［1］Oberley LW.Cell pision in normal and transformed ell:the possible role of superoxide and hydrogen peroxide ［J］.Med Hy-potheses，1981;7:21-24.
［2］Ha HC，Yager JD，Woster PA，Casere RA.Structural specifici-ty of polyamines and ployamine analogues in the protection of DNA from strand breaks induced by reaction oxygen species ［J］.Biochem Biophys Res Commun，1998Mar6;244（1）:298-303.
［3］MS EL，Siegel BV.Aspects of Free Radical Reactions in Biolog-ical Systems:Aging Brian ［J］.Gerontology.1980;35（1）:45-56.
［4］Slater TF.Free radical mechanisms in tissue injury ［J］.Bio-chemistry，1984;222（1）:1-15.
［5］Xu YY，Guo ZC.Software of advanced medical slatistics-SPLM preliminary report ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1988;9（5）:346-349.
［6］Lennon SV，Martin SJ，Cotter JG.Dose-dependent induction of apoptosis is in human an tumour cell lines by widely perging stimuli ［J］.Cell Prolife，1991;24:203-205.
［7］Kerr JER，Wyllie AH，Currie AR.Apoptosis:A basis biological phenomenon wide-ranging implication in tissue kinetics ［J］.B r J Cancer，1972;26:239-243.
［8］Forrest VJ，Kang Y，Mclain DE.Oxidative stress induced apop-tosis prevented by trolox ［J］.Free Radic Biol Med，1994;16:675-678.
［9］Lesko SA，Lorentzen RJ，Tso PO.Role of superoxide in de-oxyribonucleic acid strand scission ［J］.Biochemistry，1980;19（13）:3023-3028.
［10］Copeland ESA.A national institute of health workshop report:Free radical in promotion-chemical pathology study section workshop ［J］.Cancer Res，1983;43:5631-5637.
［11］Cerutti P，Larsson R，Krupitza G.Pathephysiological mecha-nism of active oxygen ［J］.Mutat Res，1989;214（1）:81-83.［12］Yang RH，Hai CX，Li RZ，Wu DZ.Dose response relationship between cell proliferation and hydrogen peroxide ［J］.Aibian Tubian Jibian（Carcinogenesis Teratogenesis and Mutagenesis），1997;9（2）92-99.
［13］Liu XS，Lou LS，Jiang JK.The effect of synthetic retinoid Ro13-7410on leukemic cells HL-60in vitro ［J］.Cancer，1998;17（6）:428-430.