作者：符伟军 邵国兴 姜彦多 严友农 王禾 陈宝琦
【关键词】 膀胱肿瘤
关键词: 膀胱肿瘤;端粒酶;基因表达;免疫组织化学
摘 要:目的 研究端粒酶逆转录酶基因hTERT在膀胱移行细胞癌（TCC）中的表达，探讨其在TCC发生、发展及预后复发中的意义. 方法 采用兔抗人hTERT多克隆抗体及S-P免疫组化法检测在56例TCC及10例正常膀胱组织中的表达. 结果 hTERT在TCC中阳性表达率为64.3%，与在正常膀胱组织表达率0%相比，有显著性差异（P&<0.05）.hTERT在Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ级TCC中的表达率分别为43.8%（7/16），57.7%（15/26），100%（14/14）.Ⅰ与Ⅲ级、Ⅱ与Ⅲ级、Ⅰ+Ⅱ与Ⅲ级比较差异显著（P&<0.05）.hTERT在浅表性及浸润性TCC中的表达率为53.1%（17/32），79.2%（19/24），两者差异显著（P&<0.05）.hTERT阳性表达率与患者复发有显著相关性（P&<0.05）. 结论 hTERT表达异常可能与膀胱肿瘤的发生、发展有关.检测hTERT表达可作为预测膀胱肿瘤预后复发的潜在指标.
Keywords:bladder neoplasms;telomerase;gene expression;immunohisto-chemistry
Abstract:AIM To investigate the expression of human telomerase reverse transcriptase gene（hTERT）and to evalu-ate its clinical significance in the occurrence，development and recurrence of bladder transitional cell carcinoma（TCC）patients.METHODS Using S-P immunohistochemical method，we studied the expression of hTERT gene protein in56cases of paraffin-embedded TCC tissues and in10cases of normal bladder tissues.Their clinical significance was anal┐ysed.RESULTS The positive expression rates of hTERT gene were64.3%in patients with TCC and0%in the normal bladder tissues respectively（P&<0.05）.hTERT protein posi-tive staining was in the cytonucleus of TCC.Significant dif-ference of hTERT gene expression was observed in TCC of pathological gradesⅠ，ⅡandⅢ，its positive expression rates were43.8%（7/16），57.7%（15/26），100%（14/14）respectively.Statistical significance was found inⅠandⅢ，ⅡandⅢ，Ⅰ+ⅡandⅢrespectively（P&<0.05）.hTERT gene expression was related to the clinical stages and its posi-tive expression rates among superficial and invasive tumor were53.1%（17/32）and79.2%（19/24）respectively（P&<0.05）.The expression of hTERT was significantly positively related to the recurrence of the patients（P&<0.05）.CONCLUSION The results suggest that hTERT gene ex-pression is over expressed in TCC and the aberrant expres-sion of hTERT gene is closely related to the tumorgenesis and progression of TCC.The highly expression of hTERT gene might be regarded as a marker for the recurrence of TCC.
0 引言
端粒酶活性的异常表达与肿瘤发生、发展密切相关，编码端粒酶相关组分的基因被激活后，肿瘤细胞中的端粒长度才能稳定到一定程度，使细胞获得无限增殖的能力，已研究发现端粒酶的激活与膀胱癌细胞的生物学行为密切相关［1］ .但在肿瘤形成过程中激活端粒酶的基因改变还不清楚，端粒酶的相关基因成为肿瘤研究的新热点之一.现研究发现人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）基因是端粒酶活性的限制性组分，在肿瘤组织中的表达明显高于正常组织，提示hTERT基因和端粒酶一样可作为肿瘤诊断的有力佐证［2］ .为探讨hTERT基因在膀胱肿瘤形成中的作用，寻找更理想的膀胱肿瘤诊断标志和治疗靶点，我们检测了hTERT在获得随访结果的56例膀胱移行细胞癌（bladder transitional cell carcinoma，TCC）和10例正常对照组中的表达，探讨其在TCC发生、发展及复发中的作用.
1 材料和方法
1.1 材料 56例TCC为中国医科大学第二临床学院泌尿外科收治手术切除标本.其中，男35例，女21例，年龄35～76岁，平均发病年龄61.9岁.常规固定，石蜡包埋，制成5μm厚连续切片，HE染色复查证实诊断，均有确切的随访记录（25～55mo）.病理分级按WHO分级标准:Ⅰ级16例，Ⅱ级26例，Ⅲ级14例.临床分期按UICC-TNM分期标准:浅表性肿瘤（Tis-T1 ）32例，浸润性肿瘤（T2-4 ）:24例.另选10例活检正常膀胱粘膜对照.兔抗人hTERT多克隆抗体（美国Santa Cruz Biotechnology Inc.dilution1∶50）.S-P试剂盒（北京中山生物技术公司）.DAB（Fluka，Switzerland）.
1.2 方法 所有标本均在同一条件下，采用链霉素亲生物素-过氧化物酶法（streptavidin-biotin-peroxi-dase-complex，S-P法）染色，常规微波炉热抗原修复10min，染色步骤按说明书进行.阴性对照为PBS代替一抗的空白对照和正常兔血清替代一抗的替代对照，正常对照为活检正常膀胱粘膜组织.细胞无棕色反应或背景同空白对照者为阴性（-）;细胞呈清晰棕色反应者为阳性，根据阳性肿瘤细胞所占比例及表达强度分为:（+）细胞呈淡棕黄色或阳性细胞率&<25%者;（）细胞呈棕黄色颗粒或阳性细胞率25%～50%者;（）细胞呈深棕黄色颗粒或阳性细胞率&>50%者.
统计学处理:计算阳性率，阳性率比较采用χ2 的确切概率法检验.
2 结果
2.1 hTERT蛋白表达的定位与分布 hTERT阳性着色主要定位于肿瘤细胞的胞核内，呈棕黄色细颗粒状，其阳性细胞呈局灶性或弥漫性分布，少数病例可见细胞质着色（Fig1～3）.56例TCC中，hTERT蛋白36例阳性表达，阳性率为64.3%.10例正常膀胱粘膜组织中hTERT蛋白均阴性表达，两者比较有显著性差异（P&<0.05）.
图1 － 图3 略
2.2 hTERT蛋白表达与TCC生物学行为的关系 hTERT蛋白在Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ级肿瘤中的异常表达率分别为43.8%（7/16），57.7%（15/26），100%（14/14），随着TCC分级增加，hTERT蛋白阳性表达率及表达强度均增加，Ⅰ与Ⅲ级，Ⅱ与Ⅲ级，Ⅰ+Ⅱ与Ⅲ级比较差异显著（P&<0.05），虽然Ⅰ级与Ⅱ级比较无显著性差异，但Ⅱ级的染色强度及染色率明显高于Ⅰ级.在Tis-T1 ，T2 -T4 肿瘤中的异常表达率分别为53.1%（17/32），79.2%（19/24），hTERT蛋白在浸润性TCC中的阳性表达率明显高于浅表性TCC有显著差异（P&<0.05）.在16例复发病例中，hTERT蛋白阳性14例，阳性率87.5%.而未复发的病例中，hTERT蛋白阳性22例，阳性率55.0%.复发病例hTERT蛋白阳性率明显高于未复发病例，差异有显著意义（P&<0.05，Tab1）.
表1 hTERT在膀胱移行细胞癌组织中的表达 略
3 讨论
端粒酶（telomerase）的主要功能是以自身RNA为模板，从头合成端粒，维持染色体末端稳定.端粒酶激活可能在肿瘤发生、发展中起重要作用.人体85%～90%的恶性肿瘤细胞表现端粒酶阳性，而正常组织细胞（生殖细胞、造血干细胞、某些淋巴细胞除外）则呈阴性，说明端粒酶活化维持了端粒长度缩短与延伸的动态平衡，使异常分化的细胞不断分裂增殖、永生化［3］ .端粒酶及相关基因的表达与调控是肿瘤研究的新热点.人端粒酶包括三个主要部分:即人端粒酶RNA（hTR）、端粒酶相关蛋白（TP1）和端粒酶催化亚单位（hTERT/hEst2）.自从Meyerson等［4］ 报道克隆出人端粒酶的催化亚单位hEst2，发现在永生化细胞、癌细胞中hEst2mRNA高表达，而端粒酶阴性的细胞不表达hEst2，hEst2现称为人端粒酶的催化亚单位hTERT.最近研究认为hTERT基因对 肿瘤细胞中端粒酶活性表达起重要调控作用.在对胃癌、卵巢癌、皮肤癌等研究中发现hTERT mRNA在肿瘤组织中表达均上调，与端粒酶活性密切相关，而hTR和TP1表达与端粒酶活性无关，hTERT表达上调激活端粒酶可能是肿瘤形成的关键步骤.Ito等［5］ 发现大于90%的尿路上皮癌表达hTERT mR-NA，认为hTERT是端粒酶活性的限制性组分.Hisatomi等［6］ 发现肝细胞癌中hTERT mRNA表达水平和端粒酶活性密切相关，认为hTERT的表达水平可代替端粒酶活性用于肿瘤的临床诊断.因此，hTERT高表达可能对肿瘤细胞中的端粒酶活性是必需的，并在肿瘤形成中起重要的作用.
Zeiger等［9］ 报道细针抽吸甲状腺组织检测hTERT表达可用于鉴别良性与恶性甲状腺肿瘤，可能改变这些患者的外科处理.推测通过检测膀胱镜下活检组织的hTERT表达可为膀胱癌的临床诊断提供了一种较好的生物学标志.更有意义的是通过诱导端粒酶蛋白的催化亚单位的基因突变或反义表达而降低端粒酶活性，促使肿瘤细胞凋亡［10］ .为膀胱癌的基因靶向治疗提供了指导依据.
参考文献:
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