【关键词】 玻璃体视网膜病变
关键词: 玻璃体视网膜病变，增生性;单核细胞化学吸引蛋白质-1;巨噬细胞;T-淋巴细胞;免疫组织化学
摘 要:目的 增生性玻璃体视网膜病变（PVR）是多种细胞和细胞因子参与的一种眼内创伤修复反应.单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）对巨噬细胞和淋巴细胞有特异趋化作用.本研究目的在于了解视网膜脱离后不同时期的组织中MCP-1的表达与巨噬细胞和淋巴细胞的关系. 方法 选用视网膜手术取材标本，包括孔源性视网膜脱离的视网膜下液中的细胞成份，B级PVR玻璃体手术集取物以及PVR C/D的视网膜增殖膜，免疫组化法检测其中MCP-1，CD68 和CD3 表达状态. 结果 视网膜下液中细胞成份MCP-1的表达均为阴性或弱阳性，B级PVR手术集取物以及增殖膜中，MCP-1表达阳性程度随PVR等级的升高而逐渐增高.CD68 阳性细胞（巨噬细胞）与CD3 阳性细胞（T-淋巴细胞）的比例随PVR病变程度的增加而降低. 结论 MCP-1对视网膜脱离后的愈合过程和PVR增殖膜的形成有调节作用.
Keywords:vitreoretinopathy，proliferative;monocyte chemoatlractant protein-1;macrophages;t-lymphocytes;immunohistochemistry
Abstract:AIM To investigate the relationship between the presence of MCP-1and macrophages and T-lymphocytes in specimens obtained from retinal detachment and PVR eyes.
METHODS Specimens were obtained during retinal surgery，including cellular components of subretinal fluids in rhegmatogenous retinal detachment（RD），fluids collections during vitrectomy for PVR grade B，and epiretinal mem-branes from PVR grade C or D.Immunohistochemical detec-tion was performed to examine the distribution of MCP-1，and the presence of CD68 or CD3 positive cells in these speci┐mens.RESULTS The expression of MCP-1was negative or very weak in cells of subretinal fluid from RD.As a function of the increase of PVR grade，MCP-1expression became stronger while the rate of CD 68 （+）/CD3 （+）decreased.CONCLUSION MCP-1may modulate the wound healing af-ter retinal detachment and the formation of epiretinal mem-branes in PVR.
0 引言
增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreo-retinopathy，PVR）属于眼内组织创伤愈合的一种特殊表现，与体内其它组织的损伤修复过程一样，可以分为炎症期、细胞增生期和瘢痕期三个阶段，研究表明在PVR的整个自然病程中，是一个以巨噬细胞和淋巴细胞等炎症细胞侵润为主的慢性炎症反应［1，2］ .以往PVR病理证实，在PVR的视网膜前膜中有视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞样细胞、巨噬细胞样细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等多种细胞成分［3］ .同时在病变的组织中还发现各种细胞因子的存在，包括:TNF-α，IL-1α，血小板源性生长因子（PDGF）转化生长因子-α（TGF-α）［4］ 等.单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）是一种对巨噬细胞和淋巴细胞具有特异性趋化作用的趋化因子 ［5］ ，眼内的RPE细胞和胶质细胞在某些炎性因子的刺激下可以合成MCP-1［6］ ，而且在PVR的前膜组织中存在这种因子［7］ .我们观察MCP-1在不同时期PVR组织中的存在与巨噬细胞和淋巴细胞出现的关系，以进一步探讨PVR发病过程中MCP-1和炎症细胞的相互作用.
1 材料和方法
1.1 材料
标本来源于1997-09/2000-03在西京医院眼科住院的视网膜脱离患者56名.其中12例为无明显诱因的裂孔源性视网膜脱离行电凝环扎和放液术时所取的视网膜下液，经离心（1500r・min
-1 ，5min），取沉淀物制作细胞涂片，40g・L-1 多聚甲醛固定30min，4℃，干燥后待用.
44例PVR患者在行玻璃体切割术时取材，PVR分级标准参照1983年美国视网膜学会分级方法.其中20例PVR B级取玻璃体切割液集取物，同样经离心沉淀后取沉淀物;24例PVR C级以上患眼行玻璃体切割术时取视网膜表面增殖膜标本，其中下膜14例，前膜10例.以上组织用40g・L-1 多聚甲醛固定30min，4℃.经脱水、透明和浸蜡，制成腊块.最后制成5μm厚的切片，贴附于用多聚赖氨酸涂片的玻片上.CD3 为泛T淋巴细胞标记物，而CD68 为巨噬细胞标记物，抗CD3 和CD68 抗体（小鼠，中国博士德公司），抗人MCP-1抗体（小鼠，美国PharMingen公司），免疫组化试剂盒（中国博士德公司）.
1.2 方法
免疫组织化学染色:切片浸入7.5mL・L-1 h3 O2 -PBS，37℃，30min，以阻断内源性过氧化物酶.正常羊血清封闭消除非特异性染色.滴加小鼠特异性抗体，在湿盒内37℃保温30min.PBS振洗3次，滴加生物素化羊抗小鼠IgG，在湿盒内37℃保温30min.滴加ABC复合剂，37℃保温30min.加入显色剂显色，镜下观察，水洗中止反应，苏木精复染核，脱水透明封片.免疫组织化学标记结果，以背景清晰、棕黄色部位定位明确的细胞作为阳性细胞的计数，以连续切片的HE染色结果以×40视野计数10个视野RPE细胞数，对照该切片的免疫组化结果，记录MCP-1阳性的表达状态.MCP-1阳性细胞占色素上皮细胞10%以下为弱阳性（±），10%～69%为表达阳性（+），阳性细胞占同类细胞70%以上者为表达强阳性（）.CD68 和CD3 阳性细胞计数以每×40视野计数100个细胞中的阳性细胞数，每个标本计算5个视野，取其平均值，计算每个标本的CD68 阳性细胞/CD3 阳性细胞比例（CD68 /CD3 ）.统计学分析:结果用x ±s表示并进行χ2 和t检验.
2 结果
单纯裂孔源性视网膜脱离12例视网膜下液的离心沉淀物细胞涂片中有巨噬细胞、淋巴细胞和RPE细胞，MCP-1表达均为阴性或弱阳性.PVR B级20例玻璃体切割集取物中，可见散在的玻璃体纤维，以 及散在的单核细胞和RPE细胞.免疫组化检测结果:MCP-1表达弱阳性7例，其CD68 /CD3 比例为4.5±1.7;MCP-1阳性11例，CD68 /CD3 比例为2.7±1.3;MCP-1强阳性2例，CD68 /CD3 比例为2.5±1.3.在PVR C级的10例中，细胞成份较多，散在分布于增殖膜上（Fig1），MCP-1阳性5例，CD68 /CD3 比例为1.3±0.6，强阳性5例，CD68 /CD3 比例为1.1±0.5;在PVR D级的14例中细胞成份较C级明显减少，且增殖膜中央多为胶原组成，细胞成份主要分布于膜的表面（Fig2）.MCP-1阳性4例，CD68 /CD3 比例为0.8±0.4，MCP-1强阳性10例，CD68 /CD3 比例为0.4±0.3.PVR B级与C，D级间MCP-1的表达有明显的差异性（P&<0.01），C级MCP-1的表达也低于D级（P&<0.05）.随着MCP-1表达的增强，CD68 /CD3 的比值亦明显降低（P&<0.01）.
3 讨论
我们发现，随着PVR进程的发展，MCP-1表达阳性率逐渐增高.视网膜下液中细胞MCP-1的表达为阴性或弱阳性;在PVR B级的玻璃体切割集取物中，MCP-1在细胞中有较高的阳性率;在PVR的前膜和下膜中，MCP-1的表达均为阳性或强阳性.而且随着MCP-1表达阳性的增高，CD68 /CD3 比例逐渐降低，在PVR B和C级中，巨噬细胞占较多的数量，而在PVR D级的增殖膜中，T淋巴细胞逐渐占较多的数量. MCP-1作为一种趋化因子，可以特异地趋化巨噬细胞和淋巴细胞到炎症部位，而参与炎症反应.MCP-1在PVR和视网膜脱离后的玻璃体中可以检测到，而患者的血液中为阴性，说明其产生是一种局部的反应.同时有研究表明眼内多种细胞如RPE细胞、神经胶质细胞等在炎性因子的刺激下可以分泌MCP-1，这些刺激因素包括IL-1β，TNF-α和淋巴细胞分泌的炎性因子等［6］ .
以往的实验表明炎症细胞成份和免疫因子可能参与PVR的形成.在PVR的视网膜前膜的研究中可以发现有活化的巨噬细胞、T-淋巴细胞和免疫球蛋白和补体存在［3］ .玻璃体腔中注射巨噬细胞可以形成视网膜前膜并形成牵拉性视网膜脱离［8］ ，在孔源性视网膜脱离的细胞较多的玻璃体液中发现其炎细胞成分主要是巨噬细胞和淋巴细胞［9］ .在我们以往的实验中发现，培养的巨噬细胞的上清液中含有IL-1β，TNF-α，IL-6和IL-8的炎性因子［10］ .MCP-1反过来又可以趋化巨噬细胞和淋巴细胞的游出并向炎症部位聚集.所以这三者的相互作用可能对PVR的发展有重要的意义.
实验表明MCP-1可以出现在PVR发生的全部过程中，包括在单纯视网膜脱离的视网膜下液中存在MCP-1.我们检测单纯视网膜脱离视网膜下液的细胞涂片中，虽然有RPE细胞的存在，但MCP-1的表达为阴性或弱阳性;在PVR眼玻璃体切割取材的标本组织中，MCP-1的表达多为阳性或强阳性.在视网膜下液中，RPE细胞是处于移行状态，在玻璃体切割取材标本中检测的细胞多处于附着于玻璃体纤维或视网膜表面的状态.我们认为在不同的状态下，RPE细胞MCP-1表达的能力是不同的，即RPE细胞在移行状态下可能会失去合成某些蛋白的能力，而在附着状态下会重新开始合成的过程.这个变化过程需要进一步实验验证.
由于收集视网膜下液时可能会混杂有血液成分，所以未将视网膜下液中的CD68 /CD3 比例进行统计.随着PVR组织病变等级的增加，CD68 /CD3 的比例逐渐降低，提示巨噬细胞可能只是在PVR病变的初中期过程中参与其过程，而T-淋巴细胞可能参与PVR后期的瘢痕化过程.这个炎症细胞出现和消退的过程 与身体其它部位的组织修复较为相似［11］ ，即随着炎症反应的进程，巨噬细胞的游出和趋化逐渐减少，而MCP-1的产生会在多种细胞因子和淋巴细胞产物的作用下继续进行.反过来，MCP-1在PVR病变的全部过程存在，并且在病变局部的表达逐渐增强，可能对巨噬细胞和T-淋巴细胞这种交替出现的过程有调节作用.
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