作者：杨瑞华，陈景元，邓中荣，刘学东，刘秀红
【关键词】 视网膜神经节细胞
关键词: 视网膜神经节细胞;细胞培养
摘 要:目的 建立视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）的体外培养方法，并研究视网膜不同类型神经细胞之间的相互作用，为RGCs的体外实验研究奠定基础. 方法 进行猪视网膜细胞混合体外培养和神经节细胞的纯化培养，观察神经节细胞生长状态及轴突生长情况，研究视网膜不同类型神经细胞之间的相互作用. 结果 视网膜细胞混合培养时，神经节细胞生长良好，纯化后的神经节细胞间连接减弱，细胞存活时间缩短. 结论 视网膜细胞混合培养有利于神经节细胞的贴壁和生长.
Keywords:retinal ganglion cells;cell culture
Abstract:AIM To establish a culture method for retinal ganglion cells（RGCs）and to investigate reciprocity among inhomogeneity cells of retina in order to lay a foundation for the experimental research in vitro.METHODS Retinal cells were cultured in commixture and retinal ganglion cells in pu-rification，to observe the state of ganglion cells and its axon.RESULTS Retinal ganglion cells that cultured in commix-ture grew very well.The connects of purified ganglion cells were weakened，and the time of cells alive shortened.CON┐CLUSION Culturing retinal cells in commixture benefits the paste and growth of ganglion cells.
0 引言
自Raff等［1］ 采用完全消化法于体外成功地培养了生后2～3d大鼠视网膜神经节细胞（retinal gan-glion cells，RGCs）以来，许多学者曾先后对其进行过研究，视网膜细胞培养常采用组织块体外培养法，用无血清培养液在高浓度氧环境下孵育［2］ ，但视网膜组织块培养难以观察神经元与胶质细胞间的相互作用，而且无血清培养液价格十分昂贵.因此，寻求一种简便易行的视网膜神经细胞培养方法，对深入探讨视网膜神经细胞损伤的细胞学和分子生物学机制及防护具有十分重要的意义.
1 材料和方法
1.1 材料
眼球来源于西安市肉联厂;木瓜蛋白酶（中科院上海生化所东风生化技术公司）;牛血清白蛋白（中国医学科学院血液学研究所）;DL-半胱氨酸，Poly-lysin（Sigma），DMEM培养基（Gibco公司）;小牛血清（杭州四季青生物工程公司）;YJ-875医用净化工作台（苏州净化仪器厂）;TE-HER式数字式CO2 培养器（日本平泽制造厂）;其它试剂均为分析纯.
1.2 方法
1.2.1 视网膜细胞混合培养
选用屠宰场宰杀后的猪立即摘取眼球，剪除周围结缔组织，清水充分洗涤，2000u L-1 的庆大霉素浸泡20min，移入超净工作台，沿眼球赤道部环形切开眼球，去除晶体及玻璃体，轻轻剥离视网膜感觉层，剪碎后加入2.5g L-1 胰酶消化30min，加入1mL DMEM-10mL L-1 小牛血清终止消化，以吸管吹打使之成单细胞悬液，离心洗涤，计数后以1×106 mL-1 细胞密度接种于培养瓶中，37℃，50mL L-1 CO2 孵箱培养.
1.2.2 视网膜神经节细胞纯化培养
眼球处理方法同上所述，将剪碎的视网膜组织置于含牛血清白蛋白（0.2g L-1 ）、DL-半胱氨酸（0.2g L-1 ）、木瓜蛋白酶（433.42mmol L-1 s-1 ）的Hanks液中，于37℃消化40min
［3］ .离心洗涤后接种培养.细胞贴壁后，以细胞擦去除残余胶质细胞，继续培养观察.
1.3 RGCs鉴定
1.3.1 倒置显微镜观察
以倒置显微镜观察细胞形态，并于细胞培养24，48h时，在倒置显微镜下用目镜测微尺测量神经节突起生长的长度.测量时在高倍镜下选取突起可完全与其它细胞突起区别的神经节细胞，每次测量选取10个.
1.3.2 电子显微镜观察
贴壁细胞经木瓜蛋白酶消化后，以平衡盐溶液洗涤2次，30mL L-1 戊二醛固定细胞24h，10g L-1 锇酸后固定30min，丙酮脱水，环氧树脂618包埋，超薄切片，用醋酸铅-枸橼酸铅双染后，JEN-2000EX型透射电镜观察.
1.3.3 免疫组织化学
将贴壁生长的细胞用40g L-1 多聚甲醛固定，抗神经元特异性烯醇化酶（NSE）常规免疫组化染色.
2 结果
2.1 光镜观察
2.1.1 视网膜细胞混合培养
接种后24h时悬浮细胞较多，少数细胞贴壁，细胞呈圆形，部分贴壁细胞可见突起（Fig1）.培养2d时，突起伸长，可见少量梭形的双极细胞.培养6d以后，可见视网膜细胞突起间相互接触，各神经细胞之间形成网络状结构，建立起非常广泛的联系（Fig2）.其中细胞可分为两类:①细胞体积较小，折光性强，伸出细长突起，抗NSE免疫组化染色阳性（Fig3），确认为神经节细胞;②细胞边界不明显，折光性差，排列紧密，分裂增殖旺盛，从形态学上判断为星形胶质细胞.继续培养2wk后，细胞突起缩短和消失，个别细胞有空泡出现，呈现逐渐趋向死亡的过渡状态.
2.1.2 神经节细胞纯化培养
于细胞贴壁后用细胞擦去除胶质细胞后继续培养，神经节细胞突起有回缩现象，且细胞突起的伸展方向背向擦除部位.部分细胞于培养4d可相互连接形成“桥”样结构，大多数细胞于生长7d后逐渐缩小，漂浮.
2.2 视网膜神经节细胞的超微结构 透射电镜下可见神经节细胞较小，核大，核膜清晰，染色质分散均匀，可见核仁，胞质量少，富含线粒体（Fig4）.
2.3 神经节细胞轴突生长情况 培养2d时，两种培养方法轴突长度分别为（43.4±14.2）μm和（49.7±14.5）μm，无明显差别，但继续培养至第6天，混合培养组细胞轴突长度为（101.6±18.1）μm，较4d前明显延长（P&<0.01），纯化培养组细胞轴突长度为（45.2±24.6）μm，较4d前未见明显增长.10d以后，混合培养的细胞生长良好，纯化培养的细胞轴突缩短或消失，可见细胞内出现空泡或细胞漂浮.
3.1 视网膜神经节细胞培养方法建立
视神经、视网膜属于中枢神经系统的一部分.视网膜神经节细胞的损伤常引起不可逆性视力丧失，探讨视网膜神经节细胞损伤的细胞学和分子生物学机制及如何促进细胞轴突的再生，是临床和基础研究共同关注的热点.RGCs培养可为体外研究神经节细胞的损伤及其恢复提供最直接的实验手段.我们采用视网膜细胞消化分散培养，此法操作简便，有利于观察视网膜不同类型的细胞形态及相互作用.我们观察到培养的视网膜细胞有两类:①有细长突起伸出的小圆细胞;②增殖旺盛的扁平细胞.小圆细胞及其突起抗NSE染色阳性，确认为RGC.Melvin曾描述了类似形态的细胞
［4］ ，确认其为视网膜神经节细胞，他同时还指出分裂迅速的扁平细胞为Muller细胞或星形胶质细胞.
电镜观察显示，神经节细胞核较大，胞质少，内含大量的线粒体，说明神经节细胞的氧化磷酸化过程和能量代谢非常活跃，与中枢神经系统的结构特点非常相似，了解这一特点为研究视觉神经通路的功能提供了结构基础，对环境因素致视网膜损伤的机制研究也有十分重要的意义.
培养细胞贴壁后，去除胶质细胞，剩余较纯化的视网膜神经节细胞继续培养，细胞在6d之内生长良好，以后逐渐趋向死亡，说明用视网膜消化分散培养可获得体外RGCs培养的成功，且能够较好地观察不同细胞类型间的相互作用.
3.2 视网膜细胞混合培养的意义
体外细胞培养一般多努力使细胞纯化，以观察单一细胞群体的作用，RGCs的原代培养国内报道较少，且体外存活时间短［5，6］ ，应用神经生长因子等可促进神经节细胞的存活及轴突伸展，但因其价格昂贵，不易推广使用.Vig等［7］ 的研究表明，培养的单纯细胞与体内相比，可能处于一种激活状态，对其进行刺激后产生的效果与体内相差很大.我们的实验显示，纯化培养的视网膜神经节细胞在培养6d以后轴突逐渐缩短或消失，细胞生长趋于退化和死亡，而进行视网膜细胞混合培养，可使神经节细胞在体外培养2wk后仍维持较好的活性.研究报道，视网膜神经节细胞在受到微波辐射损伤时，最初的反应为细胞轴突缩短和消失，细胞变圆［8］ ，可见细胞轴突的变化是细胞的一种保护性反应.视网膜神经节细胞的纯化培养与混合培养相比，细胞生长时间短，细胞活性差，可能与纯化培养时，神 经细胞和其他胶质细胞之间的信号联络被切断，使细胞处于应激状态，产生自身保护反应有关.
因此，我们进行的视网膜细胞的混合培养，不仅有利于视网膜神经节细胞的生长，有利于建立和加强神经元细胞间相互联系，而且可以同时观察视网膜不同类型细胞的相互作用，用该培养模型进行视网膜损伤研究，更接近于整体条件下的反应情况.
参考文献
［1］Raff MC，Fields KL，Hakomori SI，Mirsky R，Pruss RM，Win-ter J.Cell-type-specific markers for distinguishing and studying neurons and the majorclasses of glial cells in culture ［J］.Brain Res，1979;174:283-308.
［2］Baehr M，Bunge RP.Functional status influences the ability of Schwann cells to support adult rat retina ganglion cells survival and axonal regrowth ［J］.Exp Neurol，1989;106（1）:27-40.
［3］Takahashi N，Cummins D，Caprioli J.Rat retinal cells in cul-ture ［J］.Exp Eye Res，1991;53（5）:565-572.
［4］Oka MS，Frederick JM，Landers RA，Bridges CD.Adult human retinal cells in culture:Identification of cell types and expression of differentiated properties ［J］.Exp Cell Res，1985;159（1）:127-140.
［5］Zhong YS，Jiang YQ，Xiong XL.Culture of retinal ganglion cells of rat ［J］.Zhonghua Yanke Zazhi（J Opthol Chin），1999;35（2）:137-139.
［6］Liu XD，Gong SM，Guo SY，Yang RH，Deng ZR，Chen JY.Selenium protective effects on retinal nerve cell damage induced by centimeter microwave ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（10）:897-899.
［7］Vige X，Tang B，Wise BC.Cortical neurons inhibit basal and in-terleukin-1-stimulated astroglial cell secretion of nerve growth factor ［J］.Brain Res，1992;591（2）:345-350.
［8］Yang RH，Chen JY，Deng ZR，Liu XD，Liu XH，Zhao RG.Ef-fect of zinc on lipid peroxidation induced dy microwave ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（8）:940-942.