作者：韩者艺，何凤田，陈宝军，乔泰东，王海燕，韩英，郑建勇，吴开春，樊代明
【关键词】 胃肿瘤
关键词: 胃肿瘤;人抗体，肿瘤;噬菌体
摘 要:目的 利用噬菌体表面展示技术，构建人源性胃癌抗体IgG1Fab噬菌体表面展示文库. 方法 从胃癌手术患者胃一级站淋巴结中提取总RNA，反转录成cDNA后，用PCR扩增人IgG1Fd段及κ轻链，并克隆至噬菌粒载体pCOMB3中，转化宿主菌株XL1-Blue，以辅助噬菌体M13K07超感染噬菌粒文库，构建成人源性胃癌抗体IgG1Fab噬菌体表面展示文库. 结果 得到一个含克隆数为1.2×106 ，实际滴度约为2.56×1015 pfu・L-1 的IgG1Fab片段的噬菌体表面展示文库. 结论 IgG1Fab片段的噬菌体表面展示文库的成功构建，为下一步利用亲和富集筛选技术，获得具有胃癌表面抗原结合活性的融合抗体及可溶性抗体奠定了基础.
Keywords:stomach neoplasms;antibodies，neoplasms;bac-teriophages
Abstract:AIM To construct a phage display library of hu-man IgG1Fab antibodies from lymph nodes of gastric cancer patients using phage display technique.METHODS Total RNA was isolated from lymph nodes of gastric cancer pa-tients.Fd fragment and kappa light-chain were amplified by RT-PCR and cloned into the phagemid pCOMB3and ex-pressed as a fusion protein with phage M13PⅢin E.coli XL1-Blue.In the presence of help phage M13K07，the Fab fusion protein was displayed on the surface of recombinant phage.RESULTS We have constructed a phage display li-brary of human IgG1Fab antibodies whose titer was about2.56×1015 pfu・L-1 .CONCLUSION This library could be used to prepare human IgG1Fab antibody.
0 引言
单克隆抗体的出现使肿瘤抗体介导的免疫治疗发生了突破性进展.然而，目前所用的抗体多为动物源性抗体，用于人体会产生异源性抗体反应，影响效果，限制了免疫治疗的发展.使用人源性抗体则可避免异源性抗体反应.但是，用传统方法制备人源性抗体十分困难，1990年代初建立的噬菌体表面展示抗体库技术为制备人源性抗体开辟了一条快捷途径，促进了人源性抗体的发展.我们利用噬菌体表面展示抗体库技术，从胃癌手术患者一级站淋巴结中提取总RNA，构建了胃癌人源性抗体IgG1Fab段的噬菌体表面展示文库，为下一步利用亲和富集筛选技术，获得具有胃癌表面抗原结合活性的融合抗体及可溶性抗体奠定了基础.
1 材料和方法
1.1 材料
淋巴结标本采自西京医院胃肠外科，经病理诊断为胃癌病例的一级站引流淋巴结.宿主菌株E.coli XL1-blue由本室保存，含有F’因子，携带四环素抗性基因（Tetr ）.噬菌粒载体pCOMB3含有氨苄青霉素抗性基因（Ampr ），LacZ启动子及噬菌体间隔片段和用于克隆Fd段的SpeI，XhoI克隆位点及用于克隆轻链的XbaI，SacI克隆位点.辅助噬菌体M13K07，为Phamasia公司产品，带有突变型基因Ⅱ，复制起始位点和卡那霉素抗性基因（Kanr ）.RNA提取试剂、限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶、DNA纯化试剂盒分别为Promega公司、华美生物制品公司产品，cDNA反转录试剂盒为MBI公司产品.TaqDNA聚合酶和dNTPs为Promega公司产品.引物由上海生工生物制品公司合成，序列参照文献［1］ 设计，引物浓度为50pmol・L-1 .其中P1，P2为Fd段5’端引物，P3为Fd段3’端引物;P4，P5为轻链5’端引物，P6为轻链3’端引物.
1.2 方法
1.2.1 Fd段和κ轻链基因的扩增
参照文献［2］进行，略有改动.将淋巴结研碎，采用异硫氰酸胍一步法［3］ 提取总RNA.经紫外分光测量鉴定纯度.反转录合成cDNA按照试剂盒说明操作.反转录合成的第一条链作为扩增的模板与上下游引物混合，在50μL反应体系中进行反应:95℃5min，94℃1min，62℃1.5min，72℃2min，11次循环;94℃1min，58℃1.5min，72℃2min，11次循环;94℃1min，54℃1.5min，72℃2min，15次循环;72℃8min.PCR产物经20g・L-1 琼脂糖凝胶电泳，用Mi-crospin columns纯化回收目的基因片段.
1.2.2 Fd噬菌粒文库的构建
参照文献［4］进行.用限制性核酸内切酶SpeI，XhoI酶切Fd片段和噬菌粒载体pCOMB3，于16℃连接20h，同时作线性pCOMB3自连对照.用TSS法将连接产物转化入E.coli XL1-Blue，转化产物培养1h后全部均匀涂布在LB固体培养基上（含Amp100mg・L-1 ），18h后计算总克隆生成数，代表初始文库库容量.用碱裂解法［5］ 提取重组噬菌粒pCOMB3-Fd，酶切鉴定噬菌粒.
1.2.3 Fab噬菌粒文库的构建
用限制性核酸内切酶SacI，XbaI酶切κ轻链片段和pCOMB3-Fd噬菌粒，按上述方法连接、转化，并于固体培养基上培养，计算总克隆生成数.随机挑取10个分隔良好的单克隆，提取噬菌粒酶切鉴定.
1.2.4 IgG1Fab片段的噬菌体表面展示及文库滴度测定
取部分含pCOMB3-Fab噬菌粒的菌液，用 2×YT培养液（含Amp100mg・L-1 ，2g・L-1 葡萄糖）50mL稀释至A600nm 为0.3，培养至A600nm =0.6时，加入8.5×1010 pfu的辅助噬菌体M13K07，静置10min后振摇培养1h.再离心弃上清，将细菌沉淀重悬于50mL2×YT培养液（含Amp100mg・L-1 ，Kan70mg・L-1 ）中，37℃快速振摇培养过夜.离心并收集上清即为IgG1Fab片段的噬菌体表面展示文库.将所得文库分别作10-8 ，10-10 ，10-12 梯度稀释，进行噬斑培养，测定噬斑形成单位，判定噬菌体表面展示文库的滴度.
2.1 PCR产物
采用一步法从胃癌淋巴结提取总RNA，逆转录合成cDNA经PCR扩增出目的片段，Fd片段和轻链大小约670bp（Fig1（略））.
2.2 Fd噬菌粒文库的构建
用相应限制性核酸内切酶酶切Fd片段和噬菌粒载体pCOMB3连接，连接产物经转化后培养，约长出菌落2.7×105 个，载体自连对照组约长出菌落1.0×104 个，推断重组率约为90%.pCOMB3-Fd菌粒经SpeI，XhoI酶切后，释放出约660bp大小的片段（Fig2（略））.
2.3 Fab噬菌粒文库的构建
用同样方法构建Fab噬菌粒文库，约长出菌落1.2×106 个.对照组约长出菌落1.0×105 个，随机挑取10个单克隆，其中8个经酶切鉴定含有Fab片段，推断重组率约为80%.pCOMB3-Fab噬菌粒经XhoI，XbaI酶切后，释放出约2.2kb大小的片段;经SacI，XbaI酶切后，释放出约660bp大小的片段（Fig3）. 2.4 IgG1Fab片段的噬菌体表面展示及文库滴度测定 Fab噬菌粒文库经辅助噬菌体M13K07挽救后滴定，顶层琼脂上噬斑形成单位约为2.56×1015 pfu・L -1 ，估算噬菌体表面展示文库的滴度约为2.56×1015 pfu・L-1 .
3 讨论
噬菌体抗体库技术的建立，为人源性抗体的制备提供了一条快捷途径，推动了对肿瘤抗原的研究、肿 瘤被动免疫治疗及导向治疗的发展.该技术用PCR方法可以把人免疫球蛋白全套可变区基因扩增出来，用基因工程方法制备人源性抗体.
构建抗体库的诸多环节对抗体库的质量都有影响.我们选择淋巴结细胞作为建库B细胞的来源是因为淋巴结较外周血单核细胞含有更多具有活性的成熟B细胞，经PCR扩增可得到更多的免疫球蛋白基因产物.考虑到抗体的亲和力和多样性，有学者［6］ 建议用淋巴结细胞建库.PCR引物在保证抗体基因多样性方面起着至关重要的作用，影响着抗体库能否真实地反应原始抗体基因的分布情况.我们选用目前应用最广的由Kang等设计的引物序列，较全面地包含了已知免疫球蛋白抗体基因的信息，保证了抗体基因的多样性.但由于其3’端引物为IgG1亚类，使得所扩增的Fd片段仅局限于IgG1亚类.
肿瘤的免疫诊断与治疗是现代肿瘤诊疗方法之一，人源性胃癌抗体Fab噬菌体表面展示文库的成功构建，为下一步利用亲和富集筛选技术，获得具有胃癌表面抗原结合活性的融合抗体及可溶性抗体奠定了基础.
参考文献
［1］Don LS，Tylis Y，Chang SL，Russell V，Bunya Y.Isolation of cell surface human monoclonal antibodies using phage display and magnetically-activated cell sorting:Application in immuno-hematology ［J］.J Immunol Methods，1997;206:73-85.
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［3］Cui DX，Yan XJ，Fan QY，Su CZ，Ji CH.Studies on relation-ship between musculoskeletal neoplasm and oncogene mdm2metastasis suppressor gene nm23-H1［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1997;18（1）:20-22.
［4］Shen LM，Chang SG，Chih-hung LL，Peter W，Chi-huey W，Kim DJ.Phage-display library selection of high-affinity human single-chain antibodies to tumor-associated carbohydrate anti-gens sialyl Lewisx and Lewisx ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1999;96:6953-6958.
［5］Su MQ，Yu WB，Ma YY，Zhang JF，Peng DR，Ding ZR.Rapid detection of typhimurium bacteremia by polymerase chain reaction ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med U-niv），2000;21（6）:S113-S115.
［6］Yip YL，Hawkins NJ，Clark MA，Ward RL.Evaluation of dif-ferent lymphoid tissue sources for the construction of human im-munoglobulin gene libraries ［J］.Immunotechnology，1997;3（3）:195-203.转贴于