作者：张超，胡蕴玉，白建萍，徐建强
【关键词】 细胞培养
关键词: 细胞培养;成骨细胞;骨移植 中图号:R685.3 文献标识码:A
摘 要:目的 探讨骨膜成骨细胞分离培养的最佳方法，为骨组织工程的研究提供稳定可靠的种子细胞来源. 方法 分别以组织块法、酶消化法和联合法分离培养兔骨膜成骨细胞，观察原代培养的成功率、细胞生长曲线、成骨细胞的表型特征. 结果 组织块法原代培养耗时较长，成功率低;酶消化法细胞增殖快但有大量的杂细胞掺入;联合法提高了组织块成活率，并维持了较高的成骨细胞表型. 结论 胶原酶短时预消化的联合法能够在较短时间内获得高纯度的成骨细胞，效果优于传统的组织块法和酶消化法，有望成为骨组织工程种子细胞培养的常规方法.
Keywords:cell culture;osteoblast;bone transplantation
Abstract:AIM To explore the most effective technique for the isolation and culture of periosteum derived osteoblast as a basic work for tissue engineering.METHODS Periosteum derived osteoblast of18New Zealand rabbits were isolated and cultured by means of tissue block，enzyme digestion and the combined treatment respectively.The effectiveness of each technique was evaluated by morphogenesis，proliferation and osteogenic properties.RESULTS Primary culture by tissue block took a longer time，but the incorporation of oth-er kinds of cells was more obvious by enzyme digestion.The cultured cells obtained by combined treatment had shorter duration of primary culture and maintained high osteogenic properties.CONCLUSION The combined treatment is more effective than the traditional techniques and would be the reg-ular method for the isolation of periosteum derived os-teoblast.
0 引言
组织工程学的创立和发展为骨关节创伤的修复带来了新的希望，分离培养出大量发挥正常功能的成骨细胞是一个关键［1］ .我们对传统的分离方法提出改进，以期获得更稳定的种子细胞来源.
1 材料和方法
1.1 骨膜成骨样细胞的分离
1a新西兰兔18只（本校实验动物中心），30g・L-1 戊巴比妥钠以30mg・kg-1 静脉麻醉，无菌条件下切取胫骨上段内侧面骨膜0.5cm×0.5cm，Hanks’液冲洗3次，将骨膜剪成约1mm大小，采用3种分离方法.组织块法:直接将剪碎的骨膜块接种于培养瓶中;酶消化法;2g・L-1 胶原酶（Sigma）消化4h后1200r・min-1 离心5min，收集细胞接种于培养瓶;联合法:2g・L-1 胶原酶消化20min，Hanks’液洗涤3遍后接种.培养液:DMEM高糖培养基（Gibco），含有100mL・L-1 新生牛血清（Hyclone），维生素C50μg・mL-1 （Sigma），β-甘油磷酸钠10mmol・L-1 （Sigma），青链霉素各100U・mL-1 ，二性霉素B0.25μg・mL-1 （Sigma）.培养条件为37℃，50mL・L1 CO2 ，饱和湿度.第3日换液，每周换液2次，细胞融合单层后常规传代培养.每日用相差显微镜观察细胞的生长及形态变化，记录细胞贴附、伸展及融合单层的时间并照相.
1.2 培养细胞生长曲线
不同方法培养的细胞以5×103 /孔接种于96孔培养板，以MTT法每日测定6孔细胞的吸光度，取平均值绘制生长曲线.
1.3 ALP活性
分别吸除培养4d和7d的培养孔内的液体，0.01mol・L-1 PBS洗涤3次，10mL・L-1 Triton X-100处理过夜（100μL/孔），加入ALP缓冲液、基质液各100μL/孔，37℃静置30min后加入显色液100μL/孔，紫外分光光度计测量各孔吸光度.将3种来源细胞以1×10 8 ・L -1 接种于盖玻片，24h后以PBS清洗3次，4℃丙酮固定30min，以钙钴法显色ALP.
1.4 钙结节染色
3种来源的细胞以5×104 个接种于3.5cm培养皿，原代培养4wk后PBS漂洗3次，100mL・L-1 中性甲醛固定，茜素红显色钙结节.
2 结果
2.1 细胞形态学
组织块法细胞成活率为41.8%（69/165），细胞融合单层平均时间为17.1d，细胞呈梭型，胞核椭圆居中，随时间推移胞体膨大，并有短突形成.酶消化法细胞融合时间平均为12.2d，胞体略成圆形，体积较小，核呈圆形.联合法细胞形态与组织块法一致，而细胞融合成单层的时间缩短至14.7d，细胞成活率增加到76.4%（133/174）.3种方法细胞的倍增时间无明显差异.
2.3 钙结节染色
3种方法所得细胞培养1wk时细胞呈多处集聚生长，4wk后形成明显的钙结节，经茜素红染色成红色结节.消化法为多发小钙结节，而组织块法及联合法细胞形成的钙结节体积较大，数量略少（Fig4，5（略））.
3 讨论
3.1 成骨细胞的来源
种子细胞来源是骨组织工程研究的关键问题，成骨细胞可以来自松质骨、骨髓及骨膜［2］ .骨膜基底层的成骨样细胞有较强的成骨作用，有报道将颅骨骨膜剥离后与羟基磷灰石复合植入兔背阔肌肌袋中，12wk后有大量的新骨形成［3］ .而且在通过小切口即可获得足够的骨膜组织，创伤极小使患者更容易接受，在临床上有良好的应用前景［4］ .摸索出一种最为可靠、有效的骨膜成骨细胞分离、培养方法，将对组织工程技术进入临床研究产生很大的推动作用.
3.2 分离培养和鉴定
常用的骨膜成骨样细胞的分离是组织块法和酶消化法.组织块法的原理是基质层的细胞从组织块游出后贴附伸展.此法所得细胞成分较为单一，但成功率不高，仅有41.8%的组织块有细胞存活，而且细胞增殖慢，原代培养耗时长.酶消化法应用胶原酶可以成片的将细胞从组织分离出来，形成较多的细胞克隆，不加用胰酶以减少对细胞的损害，提高了成活率.因而细胞融合单层快，原代培养时间较短.采用胶原酶短时（20min）预消化，将骨膜组织块分散，细胞容易大量释放，迅速贴附伸展，细胞融合单层的时间缩短.成骨细胞的表型鉴定主要是碱性磷酸酶，骨钙素的表达，钙结节的形成［5］ .酶消化法所得的细胞碱性磷酸酶含量显著低于组织块法和联合法，4wk后形成的钙结节体积数量较少，说明原代培养中杂细胞掺入显著增加，这必然会影响到骨组织工程的下游工作结果.胶原酶预消化后贴壁接种的联合法，有效的弥补了组织块法和酶消化法各自的缺点，能够在较短时间内获得大量的高纯度的成骨样细胞，有望成为骨组织工程种子细胞培养的常规方法.
参考文献:
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