作者：张文霁，韩泉洪，惠延年，马吉献
【关键词】 玻璃体视网膜病
关键词: 玻璃体视网膜病，增生性;T淋巴细胞;HLA-DR抗原;免疫组化染色
摘 要:目的 研究免疫介导过程在增生性玻璃体视网膜病变（PVR）发生中的作用. 方法 应用特异性单克隆抗体和免疫组织化学染色的方法对视网膜玻璃体手术取材标本，包括PVR B级玻璃体手术集取物以及PVR C，D级增生膜进行观察，检测其中CD3 ，CD4 ，CD8 和HLA-DR的表达情况. 结果 7例PVR B级的标本中，6例（85.7%）有CD3 阳性表达细胞，其中2例（28.5%）同时有CD4 阳性细胞，未发现CD8 阳性细胞，2例（28.5%）有HLA-DR阳性表达细胞存在.14例PVR C级以上的增生膜标本中，CD3 均为阳性表达，10例（71.4%）有CD4 阳性表达细胞，5例（35.7%）有CD8 阳性表达，9例（64.3%）有HLA-DR阳性表达. 结论 PVR病变组织及增生膜有T淋巴细胞的存在，提示有T细胞参与PVR的病变过程，及自身免疫反应的可能.
Keywords:vitreoretinopathy，proliferative;T-lymphocytes;HLA-DR antigens;immunohistochemical stain-ings
Abstract:AIM To investigate inflammatory and immune-mediated processes contributing to the pathogenesis of prolif-erative vitreoretinopathy（PVR）.METHODS Specimens were obtained during vitrectomy，including fluid collections of PVR grade B，and peri-retinal membranes from PVR grade C or D.Immunohistochemical staining was performed to examine the presence of CD3 ，CD4 ，or CD8 markers and（human leukoiyte antigen，HLA）HLA-DR positive cells in these specimens.RESULTS CD3 positive cells were found in6of7specimens of PVR B grade，and CD4 positive cells were present in2of the6CD3 positive specimens.CD8 markers ex-pression was negative in all7specimens.Positive staining for HLA-DR was found in2specimens.In14PVR C，D mem-branes，lymphocytes expressing CD3 markers were observed in all，whilst T lymphocytes expressing CD4 and CD8 markers were found in10and5of14membranes，respectively.Posi-tive staining for HLA-DR was found in9of14membranes.CONCLUSION Findings indicate that T lymphocytes are present in PVR membranes and may be activated.These cells may play a potential role in the development of PVR.
0 引言
增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreo-retinopathy，PVR）是裂孔源性视网膜脱离手术失败的主要原因.PVR属于眼内发生的过度损伤修复过程，经历炎症期、增生期和瘢痕期三个阶段，是一个以巨噬细胞和淋巴细胞等炎症细胞浸润为主的慢性炎症反应［1，2］ .巨噬细胞诱发的PVR模型对巨噬细胞在PVR中的作用进行了较好阐明［3］ ，但Gabrilian K等证实了在PVR的病理过程中其它类型白细胞有不可替代的作用［4］ .本实验利用免疫组化技术，观察不同时期PVR病变组织中T细胞表面标记物CD3 ，CD4 ，CD8 以及人白细胞抗原HLA-DR的表达情况，以进一步探讨PVR的发病机制.
1 材料和方法
1.1 材料
标本来源于1997-09/2000-03在西京医院眼科住院的孔源性视网膜脱离伴PVR患者21名.患者无先前存在的眼内炎症性疾病.PVR分级标准参照1983年美国视网膜学会分级方法.其中7例PVR B级取玻璃体切割液集取物，离心沉淀后取沉淀物;14例PVR C级以上患眼行玻璃体切割术时取视网膜表面增生膜标本，其中下膜5例，前膜9例.以上组织用40g・L-1 多聚甲醛固定30min，4℃.经脱水、透明和浸蜡，制成蜡块.最后制成5μm厚的切片，贴附于载玻片上.
1.2 方法
①抗体和试剂:小鼠抗人CD3 ，CD4 ，CD8 和HLA-DR单克隆抗体，ABC免疫组化试剂盒均购自中国博士德公司;②免疫组织化学染色:切片浸入7.5mL・L-1 h3 O2 -PBS，37℃30min，以阻断内源性过氧化物酶.羊血清（1∶200）封闭消除非特异性染色.滴加小鼠特异性抗体CD3 （1∶100），CD4 （1∶200）CD8 （1∶100），HLA-DR（1∶100）.湿盒，37℃孵育30min.PBS振洗3次，滴加生物素化羊抗小鼠IgG（1∶200），湿盒，37℃孵育30min.滴加ABC复合剂，37℃孵育30min.DAB显色，镜下观察，水洗中止反应，苏木精复染核，脱水透明封片.
采用扁桃体切除术后的新鲜人扁桃体组织作为阳性对照;采用人角膜移植后供体眼的眼后段组织，包括视网膜色素上皮（RPE）细胞、视网膜组织、脉络膜和巩膜，以及不加一抗的标本作为阴性对照，与手术取材标本平行染色.以背景清晰、棕黄色部位定位明确的细胞作为阳性细胞.
2 结果
阳性对照组显示所用的所有单克隆抗体均呈阳性反应，阳性细胞胞质中呈现棕色或深棕色的颗粒，细胞核经复染成蓝色.阴性对照组中未见阳性染色.在7例PVR B级组织中，6例（85.7%）有CD3+ 细胞，阳性表达的细胞散在分布，呈典型的淋巴细胞形态（Fig1）;其中2例（28.5%）有CD4 和CD3 同时阳性表达细胞;在7例中CD8 均为阴性表达;2例中存在HLA-DR+ 细胞（Fig2），其中1例同时有CD3+ 细胞，另1例同时有CD3 和CD4 阳性表达，HLA-DR表达阳性的细胞呈卵圆形，细胞核较圆，并可见少量的色素.
在14例PVR C级以上的增生膜标本中，14例均为CD3+ 表达，阳性染色的T淋巴细胞存在于组织基质中，呈典型的淋巴细胞形态（Fig3）;CD4+ 细胞存在于10例中（71.4%），其中4例同时有CD8 阳性表达，8例同时有HLA-DR阳性表达，HLA-DR+ 细胞在增生膜的表面呈稀疏分布，细胞多为长梭型，细胞核为卵圆形（Fig4）;在CD4 阴性表达的4例中，1例同时有CD8 阳性表达，1例同时有HLA-DR阳性表达.
本实验中，我们观察不同时期PVR病变组织中，T细胞和HLA-DR阳性细胞的存在情况.结果显示，在大部分PVR病变组织中存在着CD3+ T细胞，CD4+ 细胞在较多的标本中存在，CD
8+ 细胞只是在少数标本中存在.但所有阳性细胞在片中所占比例都较低，约1%.HLA-DR+ 细胞在PVR B级组织中较少，在增生膜组织中数量增多.
有实验［5］ 表明，T淋巴细胞在纤维化和伤口愈合中有重要作用.激活的T细胞调节纤维化反应可通过直接分泌细胞因子如TGF-α和TNF-β或启动巨噬细胞源性细胞因子的释放［6，7］ .成纤维细胞能产生可溶性因子，延长T细胞的存活并增强T细胞对IL-2的反应
［8］ ，这一机制可能延长活跃的T细胞在炎症和纤维化部位的逗留.
主要组织相容性复合体（MHC）Ⅱ类抗原（HLA-DR）通常由抗原提呈细胞（APC）表达，从而能够提呈抗原给CD4+ T淋巴细胞，使其激活.有研究［9，10］ 表明，RPE和神经胶质细胞在炎性细胞（巨噬细胞、淋巴细胞）分泌的细胞因子如INF-γ的刺激下，可异常表达MHCⅡ分子，而具有提呈抗原的功能，可作为APC提呈自身及外来抗原，激活CD4+ T细胞介导的免疫反应.并且，用S-抗原免疫后的鼠RPE细胞与T细胞共同培养，RPE细胞可处理和提呈S-抗原，引起抗原特异性的CD4+ T细胞激活［9］ .这些都暗示着PVR发生中HLA-DR+ 细胞可能充当APC的作用［11］ ，在玻璃体视网膜的微环境中激发CD4+ T淋巴细胞介导的局部自身免疫反应.本实验结果提示CD8+ T细胞数量较少.
HLA-DR表达阳性与PVR病理机制之间的关系尚不明确.可能是有缺陷的免疫应答基因编码在HLA-DR位点的邻近区域，导致免疫调节异常，表现为自身免疫.在本实验中HLA-DR在增生膜中有较多的表达，提示PVR的病变过程与自身免疫反应有一定的关系.但是这种反应具体针对哪一种自身抗体发生，尚需要进一步研究.
在PVR B级标本中，活化T细胞和HLA-DR+ 细胞较少，而在增生膜中二者均增多，提示T细胞的活化以及诱导增生膜组织细胞HLA-DR的表达多发生在PVR形成的后期阶段，T细胞在视网膜脱离后，通过被破坏的血-眼屏障进入玻璃体腔，而T细胞的激活可能是与RPE或胶质细胞共同滞留在视网 膜表面时才开始的.虽然在本实验中，T细胞在PVR病变组织中存在数量较少，但这些少量的T淋巴细胞已可分泌足够局部浓度的细胞因子，以及引发增生膜的RPE细胞表达HLA-DR分子.
我们的研究结果表明T细胞参与PVR的病变过程，及自身免疫反应的可能.利用T细胞特异性作用药物如环胞霉素A已用于治疗眼内某些炎症.相似的特异性治疗措施将有助于PVR的预防和治疗，从而提高视网膜脱离手术的成功率.
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