作者：吴义传，郝新保，范清宇，殷剑宁，裘秀春，张殿忠
【关键词】 共刺激分子
关键词: 共刺激分子;骨肉瘤;转染
摘 要:目的 为了研究共刺激分子B7增强针对大鼠骨肉瘤的特异性细胞免疫反应，首先需获得大鼠B7分子的cDNA克隆. 方法 应用反转录PCR的方法，从大鼠脾细胞mRNA中扩增特异性片段. 结果 经测序表明，所获得的cDNA克隆与已经发表的B7-1和B7-2的cDNA序列完全一致，并将其表达载体转染UMR-106细胞系. 结论 成功获得大鼠B7共刺激分子的cDNA克隆，其转染的UMR-106大鼠骨肉瘤细胞可用于免疫诱导研究.
Keywords:co-stimulatory molecular;osteosarcoma;trans-fection
Abstract:AIM In order to evaluate the effect of co-stimula-tor B7in tumor specific T cell activation，the cDNA clones of B7should be obtained first.METHODS The first strand of cDNA was reverse transcripted from mRNA of SD rat spleen.Then fragments were amplified using specific primers and cloned into expression vector.RESULTS The automatic sequencing showed that the nucleotide sequences of cDNA were totally identical with those in publication.And the ex-pression vectors of B7-1and B7-2were successfully trans-fected into the rat osteosarcoma cell line UMR-106.CONCLUSION The transfected rat osteosarcoma cell lines with B7-1and B7-2could be used for further studies on in-duction of tumor specific immune responses.
0 引言
针对肿瘤细胞的免疫应答，除了由T细胞受体（TCR）介导的肿瘤抗原特异性信号的刺激外，还需要B7等共刺激分子的参与才可能诱导出有效的免疫应答［1］ .由于B7分子表达水平的降低，导致多种肿瘤在和免疫细胞相互作用时无法提供有效的共刺激信号，这可能是肿瘤发生免疫逃避的机制之一［2］ .为了探讨B7分子在骨肉瘤发病中的意义及其潜在的治疗价值，我们应用反转录PCR的方法克隆了大鼠的B7-1和B7-2cDNA.
1 材料和方法
1.1 RNA提取
取SD大鼠脾脏，用Dako的组织细胞分离器得到单细胞悬液，然后用Promega的总RNA提取试剂盒提取脾细胞总RNA待用.
1.2 PCR引物设计
根据文献报道的大鼠B7-1和B7-2的cDNA序列［3］ ，设计两对引物如下:B7-1P1TCATGGCTTACAGTTGCCAGCT，P2GAT-CAAACAGTCTGTTCAGCTG;B7-2P1TCATG-TATGTCGTAAAGACATG，P2GATTACTGCT-GATGCAATTGGG.
1.3 反转录PCR
首先应用下游引物合成B7-1和B7-2cDNA的第一条链，AMV反转录酶为Promega公司产品，然后取5μL反转录产物按以下条件进行PCR反应:94℃5min启动反应，然后94℃1min，68℃1min，二步PCR共30个循环［4］ .反应完成后取5μL电泳，观察产物大小.
1.4 PCR产物的克隆
将50μL的PCR产物用Gibco的PCR产物纯化试剂盒纯化，然后取10μL用Klenow酶补平，同时将购自Clontech公司的pMAMneo载体经SmaI酶切，酶切产物经纯化后用于连接反应.连接反应条件为:PCR产物和载体各4μL，TaKaRa公司T4连接酶1μL，16℃反应4h.
1.5 转化和筛选
各取5μL连接产物转化常规制备的JM109大肠杆菌，涂氨苄青霉素平板后挑取5个阳性菌落酶切筛选，插入方向正确的载体克隆增菌用于测序.通过奥科公司提供的测序服务获得插入片段的测序结果.
1.6 真核表达载体的转染
UMR-106大鼠骨肉瘤细胞购自美国ATCC，培养在含100mL・L-1 小牛血清的1640培养基中.应用Gibco公司的LIPO-FECTIN将B7-1和B7-2的pMAMneo表达载体转染到UMR-106细胞中，G418筛选出阳性克隆［5］ .应用流式细胞仪检测UMR-106细胞B7-1和B7-2分子的表达情况，相应的mAb由日本Juntendo大学Maeda博士惠赠.
2.1 B7分子的反转录PCR 从SD大鼠脾细胞提取的RNA经反转录PCR后，电泳可见预期大小的扩增片段（Fig1（略））.
2.2 B7cDNA的克隆
筛选后获得插入pMAM-neo载体中的B7-1和B7-2的克隆，经NheI和SalI双酶切可见插入片段（Fig2（略））.
2.3 B7cDNA克隆的测序
测序结果如下（略）.
2.4 B7cDNA表达载体转染骨肉瘤细胞系
B7-1和B7-2的真核表达载体转染UMR-106骨肉瘤细胞系后经G418筛选获得抗性克隆.
2.5 转染细胞系的B7分子表达
用流式细胞仪检测转染细胞系UMR71T和UMR72T相应的B7分子表达，结果发现B7-1和B7-2分子的表达分别提高了41%和27%.
3 讨论
越来越多的证据表明，人类肿瘤免疫原性低下的可能原因之一在于缺乏共刺激分子的表达，在很多情况下，单有肿瘤抗原特别是弱的肿瘤抗原尚不能有效地刺激机体产生免疫反应，它们往往被免疫系统所忽略，此时需要有共刺激分子提供的第二信号的参与.在过去十年间所发现的共刺激分子中，B7-1和B7-2在诱发机体抗肿瘤免疫中的作用受到广泛重视，经转染B7基因的黑色素瘤细胞能诱导机体产生肿瘤排斥反应［6］ ，在不表达B7分子的人肝癌细胞中转染B7基因后也提高了其激活CTL抗肿瘤的能力［7］ .
关于骨肉瘤的特异性抗原研究至今尚未有突破性的进展，为了研究共刺激分子B7在增强T淋巴细胞抗骨肉瘤免疫反应中的作用及其应用价值，我们克隆了SD大鼠的B7-1和B7-2的cDNA分子，经测序结果表明，与已经发表的序列完全一致.在将其转染到大鼠骨肉瘤细胞UMR-106中以后，我们筛选出两种分子的表达明显增高的转染细胞系，以便于将其应用到我们建立的大鼠骨肉瘤模型中加以研究.
参考文献
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［3］Maeda K，Sato T，Azuma M，Yagita H，Okumura K.Charac-terization of rat CD
80 and CD86 by molecular cloning and mAB.Int Immunol，1997;9（7）:993-1000.
［4］Hao XB，Zhang LC，Zhang YH，Tao QY，Yin Y，Han XZ，Hao XK.Cloning of human Interleukin6complimentary DNA with RT-PCR.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1998;19（5）:578-579.
［5］Hao XB，Zhang YH，Qiu FH，Zhang LC，Han XZ，Yin Y，Tao QY，Hao XK.The influence of c-erbB-2gene on growth prop-erties of mouse fibroblast.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1997;18（1）:23-25.
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