作者：吴静，樊代明，时永全，苗继延
【关键词】 血管抑素
关键词: 血管抑素;真核表达;脂质体转染;肿瘤血管生成
摘 要:目的 构建鼠源性血管抑素angiostatin cDNA真核表达载体，转染人胃癌细胞株SCG7901，检测蛋白表达. 方法 采用定向克隆构建鼠源性血管抑素angiostatin cDNA真核表达载体pcDNA3.1（+）-angiostatin，酶切鉴定和测序;采用脂质体基因转染人胃癌细胞株SCG7901，G418抗性筛选;Western blot检测血管抑素的表达. 结果 酶切鉴定和测序证明成功构建了基因序列正确的血管抑素真核表达载体，经G418筛选和Western blot检测得到高表达血管抑素的细胞株. 结论 真核表达载体pcDNA3.1（+）-angiostatin转导的人胃癌细胞能够表达血管抑素蛋白，在胃癌的血管抑制基因治疗中有潜在临床应用价值.
Keywords:angiostatin;eukaryotic expression;lipofection;tumor angiogenesis
Abstract:AIM To construct angiostatin cDNA eukaryotic expression plasmid，transfect human gastric tumor cells SCG7901，and identify the expression of angiostatin.METH┐ODS Angiostatin cDNA（plasminogen k1-k3with signal peptides and HA tag）was subcloned into eukaryotic expres-sion plasmid pcDNA3.1（+）.Gene transfer into gastric tu-mor cells SGC7901was carried out by liposome（Tfx
TM ），ac-cording to the transfection protocol in the manual.Then through G418screening，stable resistant clones were ob-tained.Western blot was used to confirm the expression of angiostatin in selected clones.RESULTS The constructed plasmid pcDNA3.1（+）-angiostatin were confirmed with the right gene sequence by enzymatic digestion and gene sequenc-ing.Western blot showed that angiostatin protein was ex-pressed and secreted by SGC7901cells.CONCLUSION Gene of angiostatin in plasmid，pcDNA3.1（+）-angiostatin was expressed by transfected cells，which had potential value in angiogenesis gene theraopy of gastric cancer.
0 引言
血管生成是人体生理及病理情况下的重要生物学过程.在哺乳类动物和人成年期正常生理状态下，仅少数特定情况，如女性生殖系统的月经期出现短暂的、高度受控的血管生成过程.在一些病理状态下，如慢性炎症、关节炎等，病变处血管生成调节失控，呈现病理性增生
［1］ .血管生成是肿瘤迅速生长和转移的必要条件［2］ ，而血管生长刺激因子和抑制因子在肿瘤血管生成过程中发挥中心调控作用.血管抑素（an-giostatin）是近年发现的最有效的血管抑制因子之一，最初从Lewis肺癌荷瘤小鼠血清和尿液中分离得到，是纤溶酶原内部片段（氨基酸98～440）［3］ ，特异性抑制血管内皮细胞的增殖并诱导凋亡，可抑制体内肿瘤生长，但不直接影响肿瘤细胞在体外的增殖.重组蛋白kringles1～3活性区均具备血管抑制活性，而kringle4活性区无明显抑制血管生成作用［4］ .目前对于血管抑素抑制肺癌、乳腺癌、胶质瘤、纤维肉瘤和视网膜肉瘤等肿瘤的作用已有肯定报道［5-7］ .我们拟通过构建血管抑素真核表达载体，为进一步研究血管抑素在胃癌血管基因治疗中的意义和临床应用的可行性提供有效的方法.
1 材料和方法
1.1 材料
限制性内切酶:HindⅢ，BamHⅠ，XbalⅠ（Gibco）;T4 DNA连接酶，Rnase A（Prome-ga）;dsDNA Markers（华美生物工程公司）;Wiz-ard TM Plus Milipre DNA纯化kit（Promega）.细菌菌株DH5α，为本研究所保存.质粒pRC-angiostatin:含位于HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点间的1.4kb的an-giostatin cDNA片段，angiostatin碱基序列.质粒pcDNA3.1（+）:本实验室保存，含启动子T7 位于多克隆位点前，复制起始点SV40ori，抗氨苄青霉素及G418基因.人胃癌细胞株SCG7901由本实验室保存.兔抗HA tag多克隆抗体由本室张德新博士惠赠;辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗、Western blot kit（博士德公司）;脂质体TfxTM-Regent20（Promega）.
1.2 方法
所用常规方法参照《现代分子生物学试验手册》和《分子克隆》.
1.2.1 真核表达载体
pcDNA3.1（+）-angiostatin的构建流程示意图（Fig1（略））.
1.2.2 质粒的制备及鉴定
氯化铷法制备感受态细菌DH5;质粒pRC-angiostatin，pcDNA3.1（+），pcDNA3.1（+）-angiostatin转化宿主菌，筛选氨苄抗性克隆;参照Wizard TM Plus Milipre DNA纯化kit操作说明制备纯化质粒DNA，测定A260和A280值，测定纯度和含量;分别用HindⅢ，HindⅢ+XbaⅠ，BamHⅠ酶切鉴定，琼制糖凝胶电泳分析;用Sanger双脱氧终止法测序检测angiostatin cDNA基因序列，判断是否与应具有的碱基序列相符（Fig2）.
1.2.3 血管抑素基因片段的纯化
酶切反应体系50μL，包含:载体pRC-angiostatin2μg，HindⅢ内切酶2.5μL，XbaⅠ内切酶2.5μL，10×Buffer5μL，37℃水浴2h;酶切产物经10g L-1 琼脂糖60V电泳1h，EB染色，紫外透射下观察分析，回收HindⅢ+XbalⅠ酶切释放片段并纯化，参照核酸片段回收试剂盒（Promega）说明操作.
1.2.4 真核表达载体的构建
连接反应体系20μL，包含:从凝胶上回收纯化的angiostatin cDNA基因片段0.3μg，载体pcDNA3.1（+）0.5μg，连接酶1μL，4℃过夜;重组质粒转化宿主菌，克隆筛选，提取质粒和鉴定，操作方法如前.
1.2.5 G418筛选浓度的确定
在24孔板中每孔加入2×104 SCG7901细胞/G418（100-1000）mg L-1 ，培养14d，并观察细胞生长状况，将12d细胞全部死亡所需的最低药物浓度确定位筛选浓度.
1.2.6 胃癌细胞株SCG7901的转染和筛选
950mL L-1 乙醇沉淀构建的pcDNA3.1（+）-angio-statin，pcDNA3.1（+），用无菌去离子水重新溶解沉淀，测定含量.按Promega公司的脂质体转染操作说明转染真核细胞:在无菌条件下配制1mL无血清RP1640培养液含质粒DNA2μg，TfxTM 10μL，试验组TfX TM /pcDNA3.1（+）-angiostatin，对照组TfXTM /pcDNA3.1（+），空白对照组TfX TM ，混合后置室温下反应30min，形成DNA-质脂体复合物;对数生长期细胞2×105 个加入2mL6孔板中，培养至80%融合，用无血清培养液RP1640洗涤细胞，待转染;滴加复合物到细胞中，培养1h，更换为含150mL L-1 FBS的RP1640培养液继续培养48～72h;48h后按1 5稀释转染细胞，用含筛选浓度的G418培养液培养4wk;挑选抗性克隆，用200mg L-1 G418培养液扩大培养，镜下观察.
1.2.7 Western blot
无血清培养液培养细胞5d，收集培养上清，用lysine-sepharose纯化;120g L-1 丙烯酰胺凝胶变性蛋白电泳SDS-PAGE;用硝酸纤维素膜300V恒压电转移2h;按Western blot kit说明操作:蛋白封闭液封闭膜30min，一抗为兔抗HA-tag多克隆抗体（1 100），孵育40℃过夜;二抗为辣根过氧化酶标记的羊抗兔多克隆抗体（1 500），室温孵育1h，DAB显色.
2 结果
2.1 克隆载体pRC┐angiostatin酶切鉴定
凝胶电泳后结果显示HindⅢ+XbalⅠ双酶切和BamHⅠ单酶切载体pRC-angiostatin后均释放出大小约1.4kb的基因片段，且HindⅢ线性化载体大小约7.0kb，符合预测结果（Fig3）.Sanger测序结果证实目的片段的碱基序列与Genbank提供的序列以及公开发表的angiostatin cDNA序列完全一致（Fig4）.这说明克隆载体pRC-angiostatin带有序列正确的an-giostatin cDNA片段.
凝胶电泳结果显示，所构建的真核表达载体pcDNA3.1（+）-angiostatin经HindⅢ+XbalⅠ双酶切和BamHⅠ单酶切后，释放的片段约1.4kb，符合预计大小，证实已将angiostatin基因片段克隆入载体pcDNA3.1（+），真核表达载体pcDNA3.1（+）-angiostatin构建成功（Fig5（略））.
2.3 基因转染和细胞克隆鉴定 转染细胞经350mg L-1 G418筛选25d后得到抗性克隆，镜下观察细胞形态无明显改变.Western blot检测培养上清中蛋白表达发现，转染细胞分泌表达成熟的angiostatin蛋白，分子质量为Mr38000，与预计结果相符（Fig6，7（略）.
3 讨论
肿瘤的生长和转移需要形成自身的血供以获取必要的营养，排除代谢产物，并起始远端转移途径作用.无血供肿瘤增至一定体积后，在局部缺氧的宿主环境中激活某些转录因子（如:缺氧诱导因子1，HIF1），促进血管生长刺激因子表达，同时降低抑制因子产生，启动血管生成［8］ .肿瘤血管生成受多种因素调节，例如缺氧、pH值、肿瘤表面脱落物、癌基因和血管生长调节因子等，其中血管生长刺激因子与抑制因子间平衡决定了血管的发展方向［9］ .现已分离出多种血管生长刺激因子，例如VEGF家族、FGF家族、Angiogenin等;血管抑制因子例如angiostatin，endostatin，IP10等.血管抑素是最有效的抑制因子之一，已证实能抑制体内多种肿瘤的生长转移和体外血管内皮细胞增殖.
肿瘤血管生长在临床上有非常重要的意义，与肿瘤恶性程度相关，并影响恶性肿瘤的结果，是一种独立的预后标志［10］ .在人的多种肿瘤中都存在这种关系，如:乳腺癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、小细胞肺癌、黑色素瘤和肾细胞瘤等.肿瘤血管密度不仅预测患者存活率，而且预示了转移瘤的发生机率和生成模式［11］ .现在肿瘤血管抑制治疗凭借其不易产生耐药、抑瘤谱广泛、毒副作用小、易达靶细胞等优势已成为引人注目的热点［12］ .目前主要可分为二类，抑制血管生成和阻断已形成的血管.随着基因工程技术也被引入肿瘤血管抑制中，肿瘤血管基因治疗已在实验室取得成功［13］ .目前用于外源基因真核表达的载体可分为病毒载体和非病毒载体两大类［14］ .病毒载体虽然转染效率高，但特异性差，可能激发宿主机体免疫;非病毒载体包括脂质体、DEAE，裸DNA注射等，脂质体具有安全性好、基因容量大，操作简便、性能稳定等特点.因此本研究选用该方法转染目的基因.血管抑素angiostatin与放射性治疗显示出的良好效果，以及重组蛋白或基因转染显著抑制多种肿瘤在体内生长转移的作用均提示其在临床应用中的潜在价值［15，16］ .由于用生物提纯或基因工程重组的蛋白成本昂贵、程序复杂，因此血管抑素成为肿瘤血管基因治疗的重要分子.本研究中，在纤溶酶原的信号肽的引导下，细胞成功分泌表达成熟的血管抑素活性蛋白，为进一步研究其对胃癌的影响及作用机理提供方法和可能.
总之，本试验成功构建了血管抑素angiostatin真核表达载体pcDNA3.1（+）-angiostatin，并转染入人胃癌细胞株SCG7901，获得稳定表达血管抑素的阳性克隆，为深入研究其作用机制，促进临床应用奠定基础.
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