作者：吴子明 王锦玲 王尔贵 姜鸿彦 邓瑶珠 刘顺利
【关键词】 迷路/外科学
关键词: 迷路/外科学;前庭神经核;前庭;豚鼠;神经胶质原纤维酸性蛋白
摘 要:目的 观察左侧迷路切除后前庭内侧核（MVN）胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达变化. 方法 左侧迷路切除后，不同存活时间行前庭内侧核GFAP二步法免疫组化染色. 结果 一侧迷路切除（UL）后可诱导双侧MVN区星形胶质细胞GFAP免疫反应增强，且术侧大于未损侧，GFAP反应在术后10h已较正常对照增强，20h强于10h，此后40h至20d GFAP反应处于下降趋势. 结论 UL后可诱导MVN区胶质细胞GFAP免疫反应增强.初级前庭传入或中枢前庭神经元的静息放电降低可能与胶质细胞反应有关，但其在前庭代偿中的作用尚有待研究.
Keywords:labyrinth/surgery;vestibular nuclei;vestibule;guinea-pig;glial fibrillary acidic protein
Abstract:AIM To observe the expression of GFAP in the medial vestibular nucleus（MVN）following unilateral labyrinthectomy（UL）.METHODS After secting left labyrinthectomy，the immunohistological staining of GFAP was performed.RESULTS GFAP staining enhancement was induced in bilateral MVN following unilateral labyrinthectomy.However，that of the lesioned side was stronger than that of the unlesioned side.The reaction be-came evident10h post-UL and was intense20～40h after the lesoin.Then it declined until20d，but was still intenser than that of the control group.CONCLUSION UL can in-duce reactive stronger GFAP immunostaining in the MVN.The fall in the resting discharge of the primary vestibular af-ferents and/or in the deafferented central vestibular neurons may cause the astrocytic reaction.But the significance of the reactive satrocytes in
the vestibular compensation is still un-known.
0 引言
前庭代偿是研究成熟动物前庭损伤后中枢神经系统可塑性的一个有用的模型.一侧迷路切除后即刻，术侧次级前庭神经元的自发活性降到零，导致两侧前庭核复合体神经元的自发性活性出现明显不对称［1，2］ .这种不对称可以使急性期观察到静态与动态的前庭功能缺陷.1～3d，其支配的前庭神经元恢复到准正常的静息活性，这可能是前庭代偿过程中，静态前庭综合征恢复的主要因素［3］ .星形胶质细胞在成熟的神经系统中最为常见，中枢或外周损伤可引起星形胶质细胞反应，这些反应包括星形胶质细胞突起的延长、还有中间丝蛋白（如胶质纤维酸性蛋白，glial fibrillary acid protein，GFAP）免疫活性的增加等.一些报道为数日或数周的改变［4-6］ .我们观察10h至20d间前庭内侧核（medial vestibular nucleus，MVN）区GFAP在一侧前庭损毁后表达的改变，并探讨其在前庭代偿过程中可能的作用.
1 材料和方法
1.1 材料 健康成年杂色豚鼠24只，体质量350～500g，雌雄不拘，随机分组:对照组（n=4）、术后10h组（n=4）、术后20h组（n=4）、术后40h组（n=4）、术后6d组（n=4）及术后20d组（n=4）. 1.2 方法 ①豚鼠以速眠新（846合剂）注射液（0.8mL kg-1 ）麻醉.取耳后下切口，暴露听泡并打开.以显微剥离子及吸引器打开前庭并破坏、吸除耳石器及壶腹嵴等，将浸有无水乙醇的明胶海绵涂布复达欣粉后置入前庭，缝合切口，造模完成，动物置于亮处恢复.动物养至预定时间以过量戊巴比妥纳麻醉，自左心室向主动脉插管，快速注入生理盐水200mL冲洗，以40g L-1 多聚甲醛600mL灌注固定.断头并剥除颅骨，取下脑干前庭核区及对应小脑区40g L-1 多聚甲醛液中后固定，石腊包埋，切片厚4μm行GFAP免疫组化反应.②二步法免疫组化染色:为石蜡切片常规脱蜡至水化，微波抗原修复，30mL L-1 h3 O2 灭活内源性过氧化物酶，胰酶消化10min，50mL L-1 正常山羊血清封闭10min，倾去血清，加兔抗GFAP（博士得公司），4℃湿盒过夜，37℃复温1h，加入酶标二抗（DAKO，美国）恒温30min，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片.免疫组化对照实验采用同等稀释度的正常家兔血清及血清稀释液替代GFAP抗体.③对照实验:包括以PBS或正常羊血清代替一抗.两种均未观察到特异性染色.④结果判定:阳性细胞记数标准为免疫染色阳性胞体，或无胞体但阳性胶质细胞突起向一中心点辐辏.各组动物取相同切面的切片3张，每组动物共记数12（4×3）张切片.每张切片在200倍率下选一个阳性细胞最多的视野记数.
统计学处理:采用SAS软件行t检验.
2 结果
2.1 手术组动物的行为学特征 所有列入实验组的动物术后均出现明确的单侧前庭外周损毁的行为学特征.这些特征包括:自发性眼震，倾倒、头位偏斜及绕圈行为等，不典型者剔除.
2.2 对照组MVN区GFAP的免疫反应性 对照组豚鼠MVN区观察到GFAP阳性星形胶质细胞，主要为原浆型星形胶质细胞（又称苔藓细胞）.突起较粗短，有若干细小分支.
2.3 前庭损毁后GFAP在MVN区的表达 左侧前庭损毁后，双侧在MVN区GFAP反应都增强，但损毁侧更为明显，反应的星形胶质细胞以原浆型为主，不同存活时间GFAP阳性细胞计数的比较如下:侧损毁术后10h，MVN区GFAP反应较对照组增加（Fig1），且左侧强于右侧.术后20h，GFAP在MVN区反应强于10h（Fig2），左侧强于右侧;术后40h，GFAP在MVN区反应有所减弱，弱于20h（Fig3）;术后6～20d GFAP反应处于下降趋势（Fig4）.统 计分析表明:前庭损毁组受损侧10h～20d前庭内侧核区GFAP阳性反应细胞数同正常对照组比较差别显著（P&<0.01）;而未损侧10h～6d前庭内侧核区GFAP阳性反应细胞数同正常对照组比较差别显著（P&<0.01），20d时与对照组差别不显著（P&>0.05）.
3 讨论
星形胶质细胞在中枢神经系统中大量存在，其对前庭神经元执行正常功能是至关重要的，这些作用包括:填充于神经元之间或起隔离和绝缘作用;监测中枢神经细胞间隙;参与调节水和离子的平衡，并参与神经元的正常代谢活动;对多种损伤均出现反应以及屏障作用［7］ .鉴于星形胶质细胞功能繁杂及其重要性，在耳外周及中枢胶质细胞的研究逐渐增多.
MVN在主要的前庭核中细胞密度最高，其主要功能是从半规管传递冲动至眼外肌运动核，它对于水平眼球运动的共轭调节可能具有特别的意义，而且它似乎有更宽阔的活动空间，适合于整合来自不同系统的神经冲动［11］ .很多研究表明，前庭内侧核在前庭代偿中起核心的作用.MVN参与中枢前庭网络的神经元可塑性，这种可塑性使得一侧迷路切除后，处理前庭信息的中枢结构重新达到平衡.据报道，豚鼠MVN能够恢复神经元的静息活性，该静息活性的恢复与眼动及姿势平衡不对称相平行［3］ .
本结果显示，一侧迷路切除后可诱导双侧前庭内侧核区星形胶质细胞GFAP免疫反应增强，且术侧大于未损侧，GFAP反应在10h时已较正常对照增强，20h强于10h，此后40h～20d GFAP反应处于下降趋势.一般认为其为星形胶质细胞对前庭神经退变的反应［4，6］ .这些反应包括胶质细胞肥大及胶质细胞增生，且前庭损毁侧反应强于未损侧.然而因为这一时期，前庭神经没有形态学上的退变发生，传统观点认为星形胶质细胞特异性地对细胞退化碎片发生增生反应.本结果显示星形胶质细胞的表达可能受神经元活性的调节，因为在前庭损毁后10～20h，前庭核细胞的静息活性明显下降甚至为零［1］ .GFAP表达是星形胶质细胞肥大的标志，一项研究表明星形胶质细胞特异性中间丝蛋白（如GFAP）在强神经元活性下可上调［8］ .培养的星形胶质细胞施以神经递质后丝状伪足会延长，这种反应在数秒内发生，不可能涉及基因诱导反应［9］ .由于神经元活性改变会引起神经递质的释放，星形胶质细胞增生反应或与此有关.现认为胶质细胞在中枢神经系统突触释放的谷氨酸盐的去除和代谢中起重要作用，谷氨酸盐去除后使其低于毒性水平，免去神经元的兴奋性毒性作用.本结果与Waele等［5］ 基本一致，但与Li等［6］ 有差别.其可能主要归因于本研究和后者损毁方式不同，本研究为破坏前庭外周感受器，后者为前庭神经节切除，前庭神经节的切除对前庭初级传入的阻断可能更完全.
MVN在前庭代偿中起重要的作用，MVN区星形胶质细胞的增生可能对前庭代偿产生相应的影响.星形胶质细胞通过诸如营养和副产物转运机制来促进MVN功能的维系，并调节突触间隙谷氨酸盐，但同时不应忽略星形胶质细胞可能的负面影响，如MVN间的星形胶质可能会成为局部神经元轴突发芽回路重建的障碍.研究发现:前庭核区存在糖皮质激素受体，糖皮质激素可促进前庭代偿，而糖皮质激素受体还与神经细胞粘附分子参与的胶质细胞增生的调控有关［12-14］ .也有研究表明，星形胶质细胞可产生神经肽、神经递质和生长因子，而这些既往认为只有神经元才具有这样的功能［10］ .
总之，一侧前庭损毁可诱导出双侧MVN区星形胶质细胞GFAP反应增强，且损毁侧强于未损侧.星形胶质细胞反应可能保护MVN区神经元免受兴奋性氨基酸（如谷氨酸盐）的神经毒性作用，并可能调制MVN区神经的活性，但同时不应忽视其可能对前庭代偿的负面影响，因为其可能妨碍MVN区神经元新建联系的形成.进一步研究星形胶质细胞有助于了解其与前庭代偿的关系.
参考文献
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