作者：路凡 赵忠良 殷缨 杨辉 陈苏民
【关键词】 人
关键词: 人;受体，白细胞介素1;基因;基因表达;大肠杆菌
摘 要:目的 获得一株重组人白细胞介素1受体拮抗蛋白的高效表达菌株，为研究各种急慢性炎症疾病的发病机制以及拮抗IL-1的生物学效应奠定基础. 方法 分离人外周血淋巴细胞，提取mRNA，反转录PCR获得人白细胞介素1受体拮抗基因（hIL-1ra），克隆入大肠杆菌表达载体，从而构建高效表达人IL-1ra的重组菌株. 结果 成功构建了IL-1ra的高效表达菌株（pLDH-hIL1ra），序列测定与文献报道一致.12%SDS-PAGE分析显示此菌株所表达的目的蛋白产物相对分子质量为23ku，与预期结果相符.光密度扫描重组hIL-1ra蛋白质占细菌总蛋白的30%. 结论 在大肠杆菌中成功地表达了hIL-1ra基因.
Keywords:men;receptors，interleukin-1;genes;gene ex-pression;Escherichia coli
Abstract:AIM To obtain a high expression clone of human interleukin1receptor antagonist（hIL-1ra），which is likely to be of great importance in the pathogenesis of both acute and chronic inflammatory diseases and a competitive inhibitor of the binding of IL-1to IL-1R.METHODS mRNA was
extracted from human peripheral blood monocytes（PBMC），and the coding sequence of hIL-1ra was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction.The expression vec-tor pLDH-hHIL1ra was constructed by inserting the PCR products of IL-1ra into the specially designed prokaryotic vec-tor pLDH99.RESULTS By temperature induction，the IL1-ra was highly expressed in E.coli DH5α.12%SDS-PAGE showed that the molecular weight of expression band was about23ku，and the expression protein accounted for30%of total bacterial protein.CONCLUSION Human IL-1ra has effectively been expressed in E.coli.
0 引言
人白细胞介素1受体拮抗剂（interleukin-1recep-tor antagonist，IL-1ra）是在某些白血病患者血清和尿中以及单核细胞培养上清中发现一种多肽性质的IL-1特异性抑制因子，可由LPS刺激的单核细胞，PMA，PHA，CSF刺激的单核细胞系产生［1］ .实验表明，LI-1ra可阻断LPS引起的家兔死亡、减轻免疫复合物所诱导的炎症、抑制小鼠骨髓移植后GVHR的发生、提高存活率、并能防治动物实验性结肠炎［2，3］ .在临床上，IL-1ra可用于治疗败血已进入Ⅲ期临床验证）、类风湿关节炎、脓毒症、化脓性休克等［4］ ;在基础研究中，IL-1ra可以用于研究急慢性炎症的发病机制.因此，利用基因工程技术来生产IL-1ra，无论是在基础研究还是在临床应用均具有重要意义.
1 材料和方法
1.1 材料 表达载体pLDH99由本室赵忠良构建（Fig1）;大肠杆菌DH5α由本室保存.正常成人外周血取自作者赵忠良.PCR引物由Cybersyn公司合成（引物序列为:ATAATGC GACCCTCTGGGA-GAAAATC， CTGGATCC TACTCGTCCTC-CTGGAAG），淋巴细胞分离液（ρ=1.077）购自Sig-ma;polyATract System1000mRNA分离试剂盒购自Promega公司;SupercriptIITM 反转录试剂盒、限制性内切酶、T4DNA ligase等购自GibcoRBL公司，Klen Taq高保真PCR试剂盒购自Clontech公司;QIAEXⅡ凝胶回收试剂盒购自Qiagen公司. Sequence of sMCSs:10 20 30AGGAAACAGC TATGACCATG ATTACGAATT40 50 60TGTTTAACTT TAAGAAGGAG ATATCGGATC70 80 90CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGCAAGCT100 110TGGCACTGGC CGTCGTTTTA CAGCTT
图1 略
1.2 方法
1.2.1 人IL-1ra基因的克隆 正常成人外周血经梯度离心（梯度离心液ρ=1.077）后，收集交界层的PBMC，以Hank’液洗3遍后，以1×106 个细胞在含20mg L-1 PHA的RPMI-1640培养基中培养，置于37℃，50mL L-1 CO
2 中培养48h后收集细胞，用polyATract System1000试剂得到纯化的mRNA，SupercriptIITM 反转录得到cDNA，以此为模板，进行PCR参数为95℃，15s;55℃，30s;72℃，30s，共25个循环.
1.2.2 人IL-1ra基因在载体中的定向克隆 将表达载体pLDH99用EcoRV与BamHI双酶切，制备成一平一粘的载体片段;同时PCR产物也经BamHI酶切制备成一平一粘的基因片段.两个片段在T4DNA连接酶的催化下于16℃连接过夜，连接产物转化DH5α感受态菌.挑取阳性转化子作小量制备后进行酶切鉴定.
1.2.3 人IL-1ra在大肠杆菌中的诱导表达 取鉴定为阳性的克隆菌在32℃下培养至平台期，以1%转接至LB中，在32℃振摇至A值约为0.4时，迅速转入42℃中继续振摇4h，收集细菌以SDS-PAGE分析人IL-1ra的表达.随机选择一高表达菌株，提取质粒，在PE公司310全自动序列仪上进行插入基因的序列分析.
2 结果
2.1 人IL┐1ra基因的PCR扩增及酶切鉴定 以PHA刺激的正常成人PBMC的mRNA为模板，经PCR扩增出特异的条带，大小约为470bp（Fig2）.
图2 略
2.2 人IL┐1ra基因的定向克隆及酶切鉴定 PCR片段经DNA聚合酶补平后进行BamHI酶切，10g L-1 琼脂糖凝胶电泳分离回收此酶切片段;载体pLDH99用EcoRV与BamHⅠ双酶切后电泳回收此片段.在T4DNA连接酶作用下将两者连接，转化感受态大肠杆菌后挑选阳性转化子，经NcoI和BamHI能产生一300bp左右片段的克隆为阳性克隆，将其命名为pLDH-hIL1ra（Fig3）.
图3 略
2.3 人IL┐1ra表达克隆的测序及诱导表达 pLDH-hIL1ra可直接以M13mp18测序，经PE公司的310自动测序仪测序，结果得到的克隆人IL-1ra基因序列与发表序列完全吻合.大肠杆菌经热诱导后所表达的相对分子质量为23ku左右，此高表达的蛋白占细菌总蛋白的30%以上（Fig4）.
3 讨论
IL-1ra是迄今所发现唯一的、天然的特异性细胞因子的抑制物［5］ .IL-1ra在体外可由LPS，PMA，PHA，CSF刺激的单核细胞系产生.IL-1家族包括3个成员，即IL-1α，IL-1β和IL-1ra（亦称IL-1χ ），三者氨基酸序列不同，但具有相似的三维结构，且均能与IL-1R结合［3］ .IL-1α，β与IL-1R结合可介导靶细胞的一系列效应;IL-1ra与IL-1R结合则不传递任何信号，从而对IL-1起特异性地抑制作用［4］ .IL-1ra的cDNA长1.8kb，可编码177个氨基酸，它含有25个氨基酸的信号肽，其成熟蛋白为152个氨基酸［6］ .IL-1ra还可抑制PBMC，骨髓细胞衍生的髓样淋巴细胞白血病自发增和自发产生IL-1，IL-6GM-CSF［7］ .在体内，IL-1ra可阻断LPS引起的家兔死亡，减轻免疫复合物所诱导的炎症［8］ ，抑制小鼠骨髓移植后GVHR的发生，提高存活率，并能防治动物实验性结肠炎［9］ .在国外，应用IL-1ra治疗败血症已进入Ⅲ期临床验证，死亡率明显下降.此外，在类风湿关节炎、脓毒症、化脓性休克也是临床的适应证［10］ ，具有不可忽视的作用，随着对其相关机制的进一步认识，IL-1ra可能会显示出更多的研究和应用价值［11］ .
在国外，Birikh等［11］ 用pGMCE原核双顺反子表达载体表达了IL-1α和IL-1ra基因，国内尚未见报道.为了获得目的基因，我们采用人LPS刺激外周血单核细胞，从中提取的mRNA，经RT-PCR成功得到hIL-1ra基因片段，进一步证明LPS可以诱导单核细胞表达IL-1ra.原核表达载体pLDH99是我们自 己设计的一种克隆、表达、测序一体化载体，具有较强的通用性，已经利用该表达载体成功表达了许多基因.在IL-1ra基因的表达过程中，利用计算机对SD-ATG之间核酸序列进行了二级结构模拟及优化设计，SD-ATG之间的序列为“ATATA”，结果表明所采用的SD-ATG序列是有利于表达的.我们还发现在SD-ATG之间的距离是三个碱基（ATA），表达量不足5%.从生产方便的角度出发，利用温度诱导方式可以降低IL-1ra的生产成本，利于大量生产，高表达蛋白产物为下游生产及临床研究提供了可靠的基础和应用价值.
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