x 作者：邓艳春 药立波 王吉村 刘新平 聂晓燕 季少平 李福洋
【关键词】 神经胶质瘤
关键词: 神经胶质瘤;杂交;肿瘤相关基因
摘 要:目的 克隆胶质瘤相关基因. 方法 取胶质瘤患者新鲜肿瘤标本及肿瘤附近正常脑组织提取mRNA，反转录成cDNA.采用基于PCR的消减杂交法获得差异的cDNA，并经多聚酶链反应扩增后克隆入T载体测序.用打点杂交法验证差异克隆. 结果 获得一胶质瘤相关的酸性成纤维生长因子基因同源物. 结论 该酸性成纤维生长因子基因同源物是酸性成纤维生长因子mRNA的不同拼接产物，可能参与胶质瘤的形成.
Keywords:nerve glioma;hybridization;tumor related gene
Abstract:AIM To search for glioma related genes.METH┐ODS Glioma sample and normal brain tissue of a patient were got under operation.mRNAs were extracted and re-verse transcribed into cDNA.Subtractive hybridization was done to get the glioma-specific cDNA which was amplified by polymerase chain reaction（PCR）.The PCR products were cloned into vectors for sequencing.Dot hybridization was used to testify the different clone.RESULTS A homolog of acid fibroblast growth factor（aFGF）mRNA was found in tumor tissue but not in normal brain tissue.CONCLUSION The new gene is the different splicing product of aFGF and might be involved in glioma genesis.
0 引言
胶质瘤是最常见的颅内肿瘤，占颅内肿瘤的31.8%［1］ ，严重地威胁着人类健康.多年来许多学者应用各种方法致力于肿瘤相关基因的寻找与研究，渴望向认识肿瘤的发病机制，最终攻克之迈近.目前已经发现EGFR，CDK4，SAS和MDM2等基因在胶质瘤中有异常扩增［2-6］ .但这些基因在胶质瘤细胞中多半是表达量上的改变，在正常脑组织中也有表达.为寻找胶质瘤与正常脑组织基因表达质的差别，即胶质瘤表达而正常脑组织不表达的基因.我们设计了该实验.
1 材料和方法
1.1 材料 胶质瘤和瘤旁正常脑组织各25mg取自一胶质瘤手术患者.
1.2 mRNA的分离及反转录 按Promega公司的mRNA磁性分离试剂盒操作手册进行，所得mRNA使用Gibco公司的SuperscriptⅡ反转录酶.参照Clontech公司的SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit方法进行（3’锚定引物为:TACGGCTGCGA-GAAGACGACAGAAT30（A/G/C）（A/G/C/T））.
1.3 扣除探针的制备 （正常脑组织）PCR条件:20μmol L-1 biotin-21-dUTP（Clontech），200μmol L-1 dNTP，1μg oligo-dT（15-18），1μL反转录模板，50μL反应体积.PCR参数为:95℃，20s;40℃，5min;72℃，3min;40个循环.
1.4 杂交、除盐及小片段 将5μL胶质瘤cDNA加到100μL扣除探针PCR产物中，在6×SSC及5g L-1 SDS的条件下65℃杂交18h.将40μL杂交液加到Sephacryl S-400spin column（Promega），离心收集液体.
1.5 除去杂交体及扣除探针 将上述液体（40μL）加到0.1mL Streptavidin MagneSphere Paramagnet-ic Particles（Promega）（将1mL磁珠悬液用0.5×SSC洗涤三次，再悬于0.1mL0.1×SSC）中，室温结合2min，65℃温育5min减少非特异性杂交，在磁场作用下分离出上清作为PCR模板.
1.6 目的cDNA的特异扩增 PCR条件:400nmol L-1 引物（TACGGCTGCGAGAAGACGAC-AGAA）;200μmol L-1 dNTP，40μL杂交分离后的上清;Klen Taq DNA polymerase1U，50μL反应体积，PCR参数为:95℃，15s;68℃，5min;25个循环.
1.7 PCR产物的回收、克隆与鉴定 采用Clontech公司的胶回收试剂盒回收PCR产物.将PCR产物克隆入T easy载体（Promega），以EcoRⅠ酶切鉴定.
1.8 打点杂交验证 PCR方法用［α-32 P］dCTP分别标记胶质瘤和瘤旁正常脑组织cDNA为杂交探针.碱裂解法提取质粒，沸水浴10min后迅速转入冰浴中使之变性.将约1g的变性DNA点在硝酸纤维素膜上（两份），室温晾干后，80℃烤2h，使之固定.分别与胶质瘤和瘤旁正常脑组织探针进行杂交，压磷屏9h后扫描.
1.9 序列测定及分析 按照ABI310DNA自动化测序仪要求进行反应和测序.通过internet利用GeneBank和SWISS-PROT等数据库对所测得的基因序列进行同源序列分析.应用ORF Finder和PC/GENE6.0软件进行读框分析.
2 结果
2.1 克隆鉴定结果 PCR产物克隆入T easy载体后用EcoRI酶切鉴定可见一大小约700bp的插段（Fig1）.
图1 略
2.2 打点杂交验证结果 用胶质瘤和正常脑组织cDNA为摸板制备探针分别与所得克隆杂交，肿瘤探针杂交为阳性而正常探针杂交阴性者为肿瘤相关基因（Fig2）.
图2 略
2.3 测序结果 用通用引物正、反向测序，得一684bp（不含引物）的序列（Fig3）.
2.4 序列分析结果
2.4.1 同源性分析结果 将该序列经internet与GeneBank发现该序列与酸性纤维生长因子（aFGF）mRNA具有高度同源性，但拼接方式不同（Fig4）.
2.4.2 读框分析结果 该序列经ORF Finder软件分析发现一完整读框，位于96～299，编码一个含67个氨基酸的蛋白质（Fig5）.
目前寻找组织细胞差异表达基因的方法主要有差示PCR法和消减杂交法.后者更容易得到差异表达的全长基因，越来越得到研究者的青睐.赵忠良等人创建的基于PCR的消减杂交法［7，8］ 在我们实验室被多人验证具有高效、特异、简便等特点.不失为寻找差异表达基因的良法.
图3 略
图4 略
图5 略
日本学者Akutsu等［9］ 曾用原位杂交法研究发现，24例颅内肿瘤患者23例aFGF mRNA阳性.将胶质瘤细胞系接种于小鼠脑内，可见胶质瘤浸润生长，原位杂交可见肿瘤细胞内有aFGF mRNA表达，而正常脑组织却未检测到aFGF mRNA［10］ .这些证据都表明aFGF mRNA与胶质瘤相关，但aFGF mR-NA在肿瘤细胞内的拼接方式却不得而知.尚无人同时做蛋白水平的检测来验证其为已知的拼接方式.
为满足生物体内信息多样性的需要，mRNA可能存在千变万化的拼接形式.但发生不同拼接的机制及其病理生理意义尚不清楚.由于拼接方式的不同完全破坏了原来的读框，编码一种新的蛋白质.计算机分析表明这种含有67个氨基酸残基的蛋白质的第15-65位氨基酸与淋巴细胞信号活化分子的第182-236位氨基酸有32%的同源性.其功能意义正在研究之中.
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