作者：刘松波 胡蕴玉 徐虎 吕荣 徐建强
【关键词】 钙
关键词: 钙;藻酸盐;软骨细胞;组织工程
摘 要:目的 构建用于软骨组织工程研究的新型细胞载体. 方法 通过向一定浓度的藻酸钠中加入二价阳离子并置入特殊模具中，经冷冻、脱水等处理，获得圆柱形藻酸钙载体，并复合软骨细胞观察. 结果 制备的藻酸钙载体具有网眼状结构，孔隙为60～160μm，嵴上并可见10～20μm的小洞.复合细胞组可见网眼中有数目不等的软骨细胞. 结论 柱形藻酸钙载体初步具备作为软骨细胞载体的条件，可用于软骨组织工程的研究.
Keywords:calcium;alginates;chondrocytes;tissue engi-neering
Abstract:AIM To fabricate a new polymer scaffold for the research on tissue engineering.METHODS Calcium algi-nate column was obtained by frozen and dehydration of com-posite of sodium alginate and calcium gluconate.The column structure of SEM was examined.Construct of the column and chondrocytes was also examined by toluidine blue stain-ing and SEM.RESULTS The calcium alginate column showed mesh structure with smaller holes in the wall.A number of chondrocytes could be seen among the nets.CON┐CLUSION As a material for chondrocyte scaffold，the calci-um alginate column might be employed in the research on car-tilage tissue engineering.
0 引言
关节软骨损伤后有限的自身修复能力使其成为骨科基础及临床研究中的难点课题，至今尚未得到很好的解决.组织工程学为关节软骨的修复提供了崭新的方法.目前应用于组织工程研究的基质材料已有多种，但距临床应用仍有一定距离.我们应用海藻酸钠结合二价阳离子制备成具有一定形状的藻酸钙载体并复合软骨细胞，通过组织切片及扫描电镜观察，探讨其作为组织工程载体材料的可能性.
1 材料和方法
1.1 试剂和仪器 小牛血清（杭州四季青生物制品公司），胰蛋白酶（华美生物工程公司，西安），Ⅱ型胶原酶（Gibco公司），DMEM高糖培养基（Gibco公司），海藻酸钠粉剂（Fluka公司），葡萄糖酸钙（无锡第七制药厂）.
1.2 柱形藻酸钙载体的制备 将10g L-1 海藻酸钠与50g L-1 葡萄糖酸钙按5 1混合，在漩涡振荡器上充分混匀，使成半流动的糊状，即刻置入直径5mm，深度8mm的特殊柱形模具中，每孔容积约0.2mL，放-20℃冰箱过夜，次日取出解冻后，经系列乙醇溶液脱水及定形，最后放入750mL L-1 乙醇溶液中消毒备用.取样本冻干行扫描电镜观察.
1.3 软骨细胞的消化分离与收集 取3周龄新西兰白兔1只，雌雄不限，无菌切取双膝关节软骨并剪成约0.5mm碎片，置10mL离心管中，以含抗生素盐水冲洗，离心后2.5g L-1 胰蛋白酶消化30min，盐水洗2次，2g L
-1 胶原酶洗1次，继而以之消化90min，吸取上清，800r min-1 离心10min，收集细胞于10mL离心管中，加入含200mL L-1 小牛血清DMEM培养基0.5mL.残余软骨粒继续以胶原酶消化，90min收集1次，共可收集4次，其后处理步骤同上.
1.4 载体与软骨细胞的复合 取制备好的藻酸钙载体4枚，复合细胞前用含200mL L-1 小牛血清的DMEM培养基冲洗浸泡.以无菌纱布轻压吸干其内的DMEM后加入上离心管中，应用毛细吸管将细胞混悬液滴于载体上，共同置37℃，含50mL L-1 CO2 孵箱中2h.
1.5 组织学及扫描电镜观察 将制备的藻酸钙载体及其与软骨细胞的复合体行30μm厚冰冻切片，甲苯胺蓝染色观察细胞与载体复合情况，同时另取标本观察扫描电镜.
2 结果
2.1 消化分离的软骨细胞计数及活力测定 消化分离的软骨细胞数目可达50×109 L-1 ，应用台盼蓝拒染试验检测活力约为85%.
2.2 藻酸钙载体的大体及扫描电镜观察 经处理所得的载体为圆柱状、白色，有一定的强度和韧性（Fig1），扫描电镜见柱型藻酸钙载体为具有一定孔隙的网眼状材料，网眼较均匀，孔隙直径可达40～160μm，孔隙间嵴上并可见约10～15μm的小孔，部分嵴的表面不甚光滑（Fig2）.
2.3 藻酸钙-软骨细胞复合体的组织学及电镜观察 甲苯胺蓝染色见载体材料为粉红色，蓝染的软骨细胞位于材料的网状空隙中，数目较多（Fig3）.扫描电镜可见在材料的孔隙中数目不等的软骨细胞呈圆球形（Fig4）.
图1 －图4 略
3 讨论
关节软骨损伤后的修复方法较多，但效果多不十分理想.组织工程方法自20世纪80年代提出后马上引起了广大科学工作者的热切关注，也为关节软骨损伤的修复提供了崭新的思路，据此设想将少量软骨细胞（或具有成软骨能力的细胞）经体外扩增并复合于某种载体材料后植入体内，获得具有生物活性和力学性能的软骨组织，植入关节软骨缺损处，修复受损的关节软骨，改善关节功能，无论在理论还是在实践上均已取得了阶段性进展［1-5］ .
海藻酸钠是一种具有多糖结构的无毒的生物材料，已经美国FDA批准成功地应用于药物剂型研制及食品工业中，也是口腔修复科中常用的塑形材料，我国学者并对其含量及分子量等进行了研究［6，7］ .不同浓度的藻酸钙凝胶放置一定时间或经特殊处理后可获得预定的形状及大小，而且具有一定的弹性和韧性，根据这一性质，将其复合兔关节软骨细胞后，采用手术方法植于关节软骨缺损中，同时可利用细胞培养的方法使细胞数目进一步增加，以满足临床需要.Hapiro等［8］ 研制成海绵体样藻酸钙载体并成功复合成纤维细胞.另有学者将复合有软骨细胞的藻酸钙凝胶注射于裸鼠体内获得组织工程软骨［9，10］ .国外学者还在治疗输尿管返流的研究中将海藻酸钠制成凝胶复合软骨细胞后注射于局部，获得满意的初期治疗效果［11］ .
由于单纯注入细胞悬液易发生细胞的丢失，不能形成修复缺损的软骨组织，因而本实验拟将软骨细胞复合于载体材料藻酸钙上植入动物体内.从实验中观察到，软骨细胞可很好地复合于柱形藻酸钙凝胶中，初步说明此种材料有望作为细胞载体应用于组织工程软骨的研究，并可复合相应的生长因子以得到更满意的结果［12，13］ .
本实验应用藻酸钙作为载体复合软骨细胞，探讨藻酸钙作为细胞载体的可行性.从本实验来看，软骨细胞可结合于载体材料上，为进一步的研究提供了实验依据.虽然海藻酸钠已长期应用于食品及医药工业中，普遍认为其无毒性，但若作为关节软骨缺损修 复的支架材料用于临床，有必要对其毒理学、生物相容性、体内降解过程等做进一步深入的研究.
参考文献:
［1］Tomminas，Nehrer S.Current concepts in the treatment of ar-ticular cartilage defects ［J］.Orthopedics，1997;20（6）:525-538.
［2］Mao TQ.The history，current situation and ruture of the tissue engineering ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1998;19（3）:185-187.
［3］Huang WC，Zhang Y，Yang HY，Liu LR.Development in tis-sue engineering of cartilage ［J］.Guowai Yixue Shengwu Yixue Fence Gongcheng Fence（Foreign Med Sci-Biomed Engineer Fasci），1999;22（5）:270-276.
［4］Breithbart AS，Grande DA，Kessler R，Ryaby JT，Fitzsimmons RJ，Grant RT.Tissue engineered bone repair of calvarial de-fects using cultured periosteal cells ［J］.Plast Reconstr Surg，1998;101（3）:567-574.
［5］Xiong M，Wang Y，Ai YF，Zhang LX.Vascular model with tubular polyglycolic acid scaffold precoated with collagen ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（11）:1006-1008.
［6］Jiang XG，Xi NZ.Measurement of content and molecular weight of sodium alginate ［J］.Shanghai YikeDaxueXuebao（J Shang-hai Med Univ），1990;17（1）:61-63.
［7］Cao ZS.Fabrication of drug carrier using sodium alginate ［J］.Guowai Yiyao-Hechengyao，Shenghuayao，Zhiji Fence（World Pharm），1994;15（6）:359-360A.
［8］Hapiro LS，Cohen S.Novel alginate sponges for cell culture and transplantation ［J］.Biomaterials，1997;18（8）:583-590.
［9］Keith T.Paige，Linda G，Cima，Michael J.Yaremchuk.De no-vo cartilage generation using calcium alginate-chondrcyte con-structs ［J］.Plast Reconstr Surg，1996;97:168-180.
［10］Paige KT，Cima LG，Yaremchuk MJ，Vacanfi JP，Vacanfi CA.Injectable cartilage ［J］.Plast Reconstr Surg，1995;96:1390-1400.
［11］Atala L.Cima G，Kim W.Injectable alginate seeded with chon-drocytes as a potential treatment for vesicoureteral reflux ［J］.J Urol，1993;150:745-747.
［12］Wang D，Hu YY，Zhao GY，Gu FY，Li XD.Scanning electron microscope examination ofβ-TCP/rhBMP-2composite in het-erotopic osteoinduction of mice ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1998;19（5）:517-519.
［13］Dong ML，Chen B，Li YL，Liu J，Gu FY.Effect of PDGF-AB on the ultrastructure of cultured fibroblasts ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1998;19（6）:633-635.