【关键词】 肺表面活性剂
关键词: 肺表面活性剂;肺泡;肺纤维化;钌红;磷脂类
摘 要:目的 观察博莱霉素（BLM）肺损伤早期肺泡Ⅱ型上皮细胞（ATⅡ）的超微结构和肺表面活性物质（PS）中磷脂（PL）及其组分的变化，探讨与ATⅡ增殖活性及修复功能的关系. 方法 BLM气管内滴注（4mg mL-1 ，5mg kg-1 ）制作28只大鼠肺损伤模型分为3，7，14，28d组，分别行肺组织标本电镜组织化学染色和支气管肺泡灌洗液（BALF）的PS中PL及其组分测定并把二者作对照分析，观察PS形态组成成分的质与量的改变与ATⅡ结构的变化间的关系. 结果 ①注药后各组均可见PS层丧失连续、均匀绒状结构，脱落入肺泡腔或聚集成块现象或散落于肺泡腔内.其中以3d组较为明显.钌红阳性表面层的厚度与对照组比较，3d组较厚，且染色深，7，14d组无明显差别，28d组较淡薄.BALF的PS中PL含量趋于增加.其中磷脂酰甘油（PG）含量3d组升高，7，14，28d组降低.磷脂酰肌醇（PI）含量变化则与此相反.②3，7d组可见ATⅡ变性坏死，甚至崩解，以3d组较明显.ATⅡ增生各组均可见，以7d组较明显.板层小体3d组数量减少，并呈空泡状.7d组开始增多，以14，28d组较为明显.③3，7d组基底膜水肿、裸露，甚至断裂，炎性细胞和间隔中的成纤维细胞等渗出到肺泡腔.14d组可见有ATⅡ转化为ATⅠ，并逐渐伸展、粘附于裸露基底膜，14，28d组也可见裸露及断裂基底膜被沉着的细胞外基质（ECM），纤维素样物质埋于其中或修复. 结论 ①BLM肺损伤PS的形态以及质与量的改变，能较特异的反映PS系统损伤程度与ATⅡ增殖活性.②BLM肺损伤早期ATⅡ具有一定的增殖、分化修复能力，且逐渐增强.
Keywords:pulmonary surfactants;pulmonary alveoli;pul-monary fibrosis;ruthenium red;phospholipids
Abstract:AIM To investigate the ultrastructures of rat alveolar typeⅡ（ATⅡ）cells and Phospholipid（PL）in pul-monary surfactant（PS）and composition of PL when lungs of rats are injured by bleomycin（BLM），and to investigate the relation between PL and proliferation and reparation of ATⅡcells.METHODS Lung injury models were made by intra-tracheal instilling of BLM.All rats were pided into four groups，3d group，7d group，14d group and28d group，Lung preparations were stained histochemically and examined by electron microscope.PL in PS of bronchoalveolar lavage fluid（BALF）were determined，results of staining and re-sults of determining were compared.The alternation to quali-ty and quantity of composition of PS and the change of struc-ture of ATⅡcells were observed.RESULTS ①Each group was found that PS layer lost continuously，appeared homoge-nous and chorionic，dropping in the pulmonary alveolies，col-lecting into masses or scattering.The change in3-day group was more apparent.Ruthenium red attaching on pulmonary surfactant was thicker and the colour deeper in3d group，no difference in7d group and14d group，thinner in28d group.Content of PL in PS of BALF was inclined to increase.Con-tent of phosphatidylglycerol（PG）increased in3d group，de-creased in7d，14d，and28d group.The change of content of phosphatidylinositol（PI）was reversed.②ATⅡcells de-genarated，necrotized，even disintegrated，in3d and7d group the change in3d group was more apparent.Prolifera-tions of ATⅡcells were found in each group，7d group was more apparent.The number of lamellar body in3days group decreased，appeared vacnolus.The number in7d group be-gan to increase，and increased apparently in14d and28d group.③Basement membrane was in dropsy，denuded，even fragmentated in3d group and7d group.Inflammatory cells and fibroblasts in septum exudated into pulmonary alveolies.We found that ATⅡcells transformed to ATⅠcells in14d group，extended gradually，attaching on bare basement mem-brane.Bare and broken basement membrane was embeded or repared by extracellular matrix（ECM）and fibrinoid sub-stance in14d group and28d group.CONCLUSION ①Morphologic change and alternation of quanlity and quantity of PS by BLM-induced pulmonary injuries can specificly re-flect injuries of PS system and proliferative activity of ATⅡcells.②ATⅡcells have certain ability to proliferate，differ-entiate，repair when lungs of rats are injured early by BLM，and the ability increases gradually.
0 引言
肺表面活性物质（PS）代谢情况能直接反映肺泡Ⅱ型上皮细胞（ATⅡ）的功能状态.尚未见到肺间质病早期PS的变化及与ATⅡ增殖活性变化关系研究的报道.我们通过PS系统的电镜组织化学观察以及支气管肺泡灌洗液（BALF）中磷脂（PL）及其组分的定量分析，探讨博莱霉素（BLM）作用于肺早期PS的分泌功能与ATⅡ形态结构间的关系，试图从PS分泌功能判断ATⅡ在肺损伤早期增殖活性及修复功能提供实验依据.
1 材料和方法
1.1 材料 健康SD大鼠56只，雌雄不拘（动物由本校动物中心提供，体质量180～200g），随机分为实验组和对照组各28只，每组再随机分4个组（每组动物数均为7只），每只大鼠取左下肺叶供制作病理标本，然后把其支气管结扎，余肺叶供高效液相色谱（HPLC）法测BALF中PL及其组分.实验组用10mg mL-1 戊巴比妥钠0.5mL ip麻醉大鼠，仰卧固定于鼠台上.颈部酒精消毒后逐层暴露气管，用1mL注射器抽取用生理盐水配成的4g L-1 BLM（日本化药株式会社生产，15mg/支，批号为98010）溶液，按5mg kg-1 药量，接7号头皮针上，经气管软骨环间隙朝向心端刺入气管，回抽见空气无阻力后，将药液缓慢注入气管.注入过程中将大鼠直立、旋转，使药液在肺内分布充分、均匀.对照组在同样条件下气管内注入相同数量的生理盐水，方法同实验组.
1.2 方法
在每只动物的肺标本中随机取4个Epon包埋块，每个包埋块取2个超薄切片制成铜网，每个铜
网随机选择8处钌红阳性的不同部位，根据镜下比例 尺测量其厚度，再计算出平均值和标准差.BALF中PL及其组分的HPLC测定参照冯力宁等［1］ 的方法.肺组织标本制作采用40g L-1 多聚甲醛浸泡固定，常规石蜡包埋切片，分别行HE和Masson染色.电镜标本的前固定液:8g L-1 钌红（钌红为德国生产，临用时现配），0.3mol L-1 二甲酸钠缓冲液（pH7.3～7.4），180mL L
-1 戊二酸，18g L-1 单宁酸.将以上4种液体储存于4℃冰箱中备用，临用时按2 2 1 1的比例配制混匀即可;后固定液:30mg mL-1 锇酸储存于4℃冰箱中备用，临用时和前固定液中，液按1 1 1的比例配制混匀即可;取材、前固定:两组动物分别于术后3，7，14，28d用腹主动脉放血法处死动物.迅速取出2mm×2mm×5mm大小的肺组织条块，放置在滴有前固定液的培养皿中.再从各条块切取约1mm 3 大小的组织块，立即投入装有前固定液的青霉素小瓶中，用封口膜密封瓶口，并用针筒抽气，以排除瓶内残留气体，直到组织块沉至瓶底.置4℃冰箱中12h;后固定:用0.1mol L-1 二甲砷酸钠缓冲液（pH7.3～7.4）将固定好的组织冲洗3次共30min，然后用1.5mL后固定液固定组织，置4℃冰箱中2h.用0.1mol L-1 二甲砷酸钠缓冲液（pH7.3～7.4）冲洗3次，共15min;脱水、包埋、切片、染色:经后固定及冲洗后的标本逐级用丙酮脱水，环氧丙烷媒浸，环氧树脂（Epon812）包埋，薄片定位，切成超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅染色，JEM-2000EX型透射电镜观察.统计学方法:以两组完全随即化设计资料的均数t检验方法处理实验数据.
2 结果
2.1 光镜观察
对照组肺泡结构正常，肺泡间隔无水肿、炎症及纤维组织增生，肺泡腔无明显渗出.实验组3d组肺泡隔增厚，炎性细胞小灶状或片状渗出，以中性粒细胞、单核细胞为主，也可见淋巴细胞.7d组肺泡炎更为明显，呈大片状炎性细胞浸润.依据Szapiel等的方法肺泡炎确定为中、重度（即3，4级）为呈大片状炎性细胞浸润，间质内成纤维细胞、毛细血管明显增多，病变严重区肺泡正常结构被炎性肉芽组织破坏.Masson染色见局部间隔呈浅蓝色，已开始有纤维化改变.14d组仍有肺泡炎，细胞浸润以单核细胞为主，纤维组织增生，出现斑片状纤维化.28d组肺泡炎较前减轻，肺泡结构破坏，部分肺泡腔消失，肺泡间隔以及肺泡腔内容物普遍呈深蓝色，涉及范围较广，已形成纤维化，纤维化程度为中、重度（即3，4级）.
2.2 电镜观察
对照组:PS层呈双相，分为电子密度致密的界面层和电子密度较低的“下相”（hy-pophase），气液界面的PS层呈连续、均匀一致内衬于肺泡腔的电子致密带（Fig1）.ATⅡ微绒毛呈细长的指状突起，微绒毛间和表面覆盖有PS，在肺泡角和上皮皱褶处该层较厚.ATⅡ胞质内有大量板层体，板层呈同心圆或平行排列，ATⅡ结构完整、清晰. 实验组:①各组PS层丧失连续、均匀绒状结构，出现断裂，脱落入肺泡腔或聚集成块现象或散落于肺泡腔，有的形成空泡（Fig2）.钌红阳性表面层的厚度，3d组较对照组厚、且染色深，7，14d组和对照组无明显差别.28d组较对照组淡薄（Tab1）.②3，7d组上皮基底膜水肿、裸露、甚至断裂，使血管腔和肺泡腔相通或直接暴露于肺泡腔.14d组可见有ATⅡ转化为ATⅠ，并逐渐伸展、粘附于基底膜（Fig3），14，28d组也可见裸露及断裂基底膜被沉着的细胞外基质（ECM）、纤维素样物质包埋于其中或修复.3，7，14d组ATⅡ变性坏死、甚至崩解，胞质内容物脱落入肺泡腔，其中以3d组较为明显.板层小体空泡化，并可见脱落的板层小体，线粒体结构破坏.各组均可见ATⅡ增生，以7d组较明显（Fig4，5），3d组ATⅡ板层小体体积数目减少，板层小体部分或完全空泡化，板层不规则且变薄，并可见肺泡腔散在脱落的板层小体.7d组板层小体开始数目增多，体积增大，以14，28d组较为显著.③7，14d组均可见有新生毛细血管，分布于靠近基底膜的纤维化区域，3，28d组则未见.仅7d组间隔及肺泡腔中可见大量浆细胞渗出，嗜酸性粒细胞也可见.④7d组肺泡腔内可见大量纤维素样物质渗出，间隔成纤维细胞增生明显.14d组间隔及肺病泡腔内可见明显胶原及弹性纤维，28d组纤维化已形成，部分肺泡结构已破坏，被纤维组织等所替代.还可见巨噬细胞增多，其内有吞噬的板层体和空泡形成.表1 钌红阳性表面层的厚度（略）
2.3 BALF中PL及其组分的测定
在HPLC图中，各PL组分出现的顺序依次为磷脂酰甘油（PG）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰胆碱（PC）.BALF中PL组分以及有关组分间的变化结果（Tab2）.表2 BALF中PL组分的变化（略）
3 讨论
PS在ATⅡ的内质网合成，通过高尔基复合体转移到板层小体中贮存.当板层小体通过胞吐作用被分泌入肺泡腔后，最终内衬于细支气管和肺泡腔内.钌红主要与粘多糖成分反应，形成沉积物，构成染色后所形成的“下相”.锇酸与PS层双胞卵磷脂反应而增加电子密度，同时锇酸被结合在组织上的钌红还原而分解成锇黑.前固定液中单宁酸能够增加反差［2］ .通过这一方法染色，可清晰完整地观察PS系统超微结构.我们试图通过本实验滴注BLM后ATⅡ的形态结构、增殖活性变化规律以及PS定性、定量分析探讨BLM肺损伤早期肺自身修复的可能性.肺泡上皮细胞结构和功能的改变可能参与肺损伤后肺纤维化的发病机制.但二者之间的关系并不十分清楚.在BLM致肺纤维化过程中，表现为部分ATⅡ变性坏死，甚至崩解，其板层小体数量减少，板层逐渐变薄或者空泡化.同时，部分ATⅡ分裂增殖以及功能、结构发生改变，导致其分泌的PS质和量上均发生变化.肺损伤后肺泡结构的重建有赖于ATⅡ的再生.我们观察到整个实验周期内ATⅡ都有不同程度的增生，其高峰在注药后的7d组，以后逐渐下降.
组化电镜以及HPLC法定量分析BALF的PS中PL及其组分的结果显示，早期PS分泌增加.其PS分泌增加的可能原因主要是ATⅡ应激性释放增多有关［3］ .由于肺泡腔内PS清除的主要途径是由
ATⅡ重摄取，因此ATⅡ结构和功能受损，导致其转运功能下降或丧失，肺泡腔内PS代谢受阻也与此有关.中后期HPLC法定量分析发现，PL总量趋于增加，这与随ATⅡ的增生肥大PS合成增加有关，中后期钌红染色阳性层厚度与对照组无明显差别，甚至28d组染色淡薄，而HPLC法定量分析中PL总量趋于增加，二者结果不一致，其可能原因是7d组中可见PS被肺泡腔内的纤维素样物质阻拦，而不能向ATⅠ展开，聚集成块状散落于肺泡腔.肺泡腔内炎性渗出的血浆蛋白、纤维蛋白降解产物等抑制PS活性或与PS结合干扰PS向肺泡腔内均匀一致的展开与PS竞争结合钌红也与此有关.
研究表明特发性肺纤维化患者BALF中PL及其组分有变化.从对BLM肺纤维化动物模型的BALF中PL及其组分的分析研究中，PL在肺纤维化时的变化规律认识不尽相同.Horiuchi的实验结果是4d降低，21，28d增加.Thrall，Low的实验结果是各个时间段均增加.我们的实验结果是除7d组与对照组比较无显著差异外，余3，14，28d组均存在显著差异.虽然各家实验结果略有差异，但在注药后PL总量均趋向于增加.PL组分的变化结果是3d组PG含量升高，7，14，28d组则下降，PI含量则在7，14，28d组均升高，两者与对照组比较有显著性差异.从而使PG/PI比值在3d组升高，7，14，28d组降低.从BALF中，PG，PI以及二者比值改变和组化电镜结果对照研究发现，注药后7，14，28d PG/PI降低，即随ATⅡ的明显增生和板层小体的数量增多、体积增大而降低，而3d组ATⅡ的破坏和板层小体的数量减少，体积变小时反而升高.至于PG先增高后降低的原因，通常认为与ATⅡ合成减少和用于构筑增生的ATⅡ有关，而PI升高认为是对PG降低的代偿.由此我们推测，PG，PI以及PG/PI的改变与Ⅱ型细胞的增殖活性、增生程度紧密相关.
另外，BLM致肺泡炎、ATⅡ受损、炎性介质的作用等病理变化通过多种途径使PS的合成、分泌和在肺泡腔表面上的吸附、扩展以及PS的再利用等多个环节发生障碍，使PS的生化成分和组分间比例失调，表面活性发生异常，不能起到降低肺泡表面张力的功能导致肺泡萎陷.研究表明细胞迁移是细胞损伤修复的基本过程.细胞迁移除炎症细胞外，还有上皮细胞等.在各种肺损伤修复过程中，上皮细胞先迁移至受损伤部位，然后增殖、分化，参与上皮再生［4］ .因此我们认为肺泡萎陷以及肺纤维化过程中肺泡腔内炎性介质渗出，细胞外基质（ECM）在肺泡腔以及间质中的过度沉着，不利于ATⅡ迁移和形成细胞-ECM间相互作用的ATⅡ周围的“几何框架”（geo-metric framework），导致ATⅡ增殖、修复障碍，成纤维细胞过度增生，而过度增生的成纤维细胞、过剩的ECM等共同分隔包埋增生ATⅡ和裸露、断裂的基底膜［5］ 影响ATⅡ自身修复功能，形成肺的纤维化.
参考文献
［1］Feng LN，jiang B，Chen WX，Liu ZG，Zhang XN，Gou L.Comparison of the phospholipid of surface active substances be-tween eustachian tube and iung in the guinea pig ［J］.Di-si Jun-yi DaxueXuebao（J Fourth Mil Med Univ），1996;17（4）:251-253.
［2］Lu YL，Lian YB.The application of mirowave irradiation to dis-playing pulmonary surfactant ［J］.Jiepaoxue Zazhi（Chin J Anat），1997;20（3）:300-301.
［3］Lewis JF，Jobe AH.Surfactant and the adult respiratory dis-tress syndrome ［J］.Am Rev Respir Dis，1993Jan;147（1）:218-233.
［4］Lesur O，Arsalane K.Lung alveolar epithelial cell migration in vitro:modulators and regulation processes ［J］.Am J Physiol，1996;330:L311-319.
［5］Kohei YC.Remodeling of the alveolar structure ［J］.Jpn J Tho-racic Cardiovasc Surg，1999;58（1）:17-26.转贴于