作者：王骊丽 ，任平，黄熙 ，张莉 ，黄敬群 ，陈建宗 ，陈晓莉
【关键词】 甘草甜素
关键词: 甘草甜素;甘草次酸;色谱法，高压液相;血浆
摘 要:目的 建立一个同时测定甘草甜素、甘草次酸血浆浓度变化监测的方法，进一步用于“脾主药动学”假说的验证. 方法 采用内标定量的反相高效液相色谱法，以甲醇-水-醋酸（88∶11∶1）为流动相，ODS-3柱（150mm×4.6mm，5μm）为固定相，在紫外250nm检测. 结果 GL，GA在此线性范围内，线性关系良好、精密度较高. 结论 本方法具有简便、灵敏、快速而准确的特点，适用于注射GL制剂或口服中药复方前后GL和GA的体内、体外的药代动力学研究，为进一步进行中药复方的药物监测奠定了基础.
Keywords:glycyrrhizin;glycyrrhetinic acid;chromatogra-phy，high pressure liquid;plasma
Abstract:AIM Establishment of method for measuring plasma concentration of the glycyrrhizin and glycyrrhetinic acid simultaneously by RP-HPLC，in order to testify the hy-pothesis of pharmacokinetics by traditional Chinese medicine.METHODS RP-HPLC with internal labeling was employed.Methanol-h3 O-acetic acid（88∶11∶1）was used as mobile phase and ODS-3（150mm×4.6mm，5μm）column as fixed phase，and detected by UV（λ=250nm）.RESULTS With-in the linear range the glycyrrhizin and glycyrrhetinic acid showed good linear relation and were detected with high pre┐cision.CONCLUSION Method is characterized by high sim-plicity，rapidity，and sensitivity，and is suitable for the in vit-ro and in vivo pharmacokinetic study of glycyrrhizin and gly-cyrrhetinic acid after oral administration or injection of GL extracts.
0 引言
四君子汤为治疗脾虚证的经典名方，其主要成分之一为甘草甜素（glycyrrhizin，GL），在体内主要是以其代谢物甘草次酸（glycyrrhetinic acid，GA）的形式被吸收，分布到各个组织器官，最终以GA的形式排出体外［1］ .甘草甜素和四君子汤被我们用作验证“脾主药动学”假说［2，3］ 的主要工具方.关于制剂和大鼠血中GL，GA测定的HPLC法已见报道［4-7］ ，在我室以前甘草甜素血药浓度测定（待发表）的基础上，为进一步验证假说的可靠性及其进行方剂治疗药物监测［8-10］ 可能性，同时测定甘草甜素及其代谢产物GA的血药浓度是十分必要的.由此经过反复实验，建立了同时测定GL和GA的反相HPLC法.其结果快速、准确、重现性好，可用于注射GL制剂或口服中药复方前后的GL和GA药物动力学研究.
1 材料和方法
1.1 材料
美国Waters公司产HPLC系统（600泵，996二极管阵列检测器，7725手动进样器），M32 色谱工作站，Digital计算机;TGL-16台式离心机（上海医用分析仪器厂）.甘草酸铵（中国药品生物制品检定所）;联苯、甲醇等试剂为分析纯（西安化学试剂厂）.雄性Wistar大鼠5只，体质量（200±10）g，（12.0±1.5）wk龄（本校实验动物中心提供）.
1.2 方法
1.2.1 色谱条件
色谱柱C18 柱（Intersil:ODS-3，150mm×4.6mm，5μm）;流动相:甲醇-水-醋酸=88∶11∶1，流速:qv=1.0mL・min-1 ，检测波长:λ=250nm;进样量为20μL.
1.2.2 对照品溶液
分别称取甘草酸铵、甘草次酸对照品4.10mg，4.10mg，各于10.0mL容量瓶中，以甲醇:h3 O（90∶10，V/V）溶解成浓度为0.410mg・mL-1 ，0.410mg・mL-1 .
内标溶液联苯为内标物，浓度为18.05mg・mL-1 .
1.2.3 血浆的干扰分析
大鼠空白血浆:来源于健康雄性Wistar大鼠［体质量（200±10）g］眼球摘除取血浆.空白血浆的测定:取400μL甲醇，置于1.0mL的离心试管中加入100μL空白血浆，用电动混匀器30s混合后，静置3min，在台式离心机上以3880g离心10min，取上清移入一次性试管中，20μL进样测定.在上述色谱条件下，空白血浆色谱峰不干扰测定.再进行GL，GA以及内标物联苯的的对照分析，方法同前其色谱峰保留时间（Fig1）.
2 结果
2.1 标准曲线及线性考察
根据实验的需要，GL进行了高、低组不同浓度范围的工作曲线制作.以高浓度为例，当ρ（GL）=410mg・L-1 ，ρ（GA）=410mg・L -1 .加入体积量按Tab1（n=5）:然后依照1.2.3的处理方法得到样品.各样品同一质量浓度下测定3次，取其平均值，以对照品峰面积与内标峰面积之比为纵坐标，进样量（μg）为横坐标进行回归（Tab2）.表1 标准曲线制作加入样品体积量（略）表2 标准曲线参数结果（略）
由上表结果表明，GL，GA在此线性范围内，线性关系良好.
2.2 日内精密度的考察 将样品溶液GL在3.69～1476mg・L-1 ，GA0.3936～1.5744mg・L
-1 的浓度范围内重复进样3次（n=6），取平均值计算日内变异系数（Tab3）.
日间精密度的考察，取同一批样品，按不同天数 测定（n=3）日间变异系数（Tab3）.测定结果本法精密度较好.以标准曲线求得理论Y值，实际所测GL面积与内标面积比为测定值，二者相比求得从大鼠血浆中GL和GA平均相对回收率（Tab3）.表3 回收率和精密度结果（略）
3 讨论
从二维、三维图谱相互观察，通过与GL、GA标准品在相同条件下对照，保留时间一致，GL为3.209，GA为6.587（Fig1）;可准确对其吸收峰定性分析，GL的最大吸收峰为250nm，GA为247nm（Fig1）.由于GL，GA都是水溶性成分，在预处理中采用了经典的甲醇除蛋白方法，可一步进行甘草甜素、甘草次酸血中蛋白的去除，从图谱观察并没有干扰且去除率很好（Fig1）.本方法的建立能快速、准确的同时测定GL和GA，保留时间无干扰.
［15］ ，甘草甜素及其四君子汤是验证该假说的良好工具，因此，本实验同时测定甘草甜素和甘草次酸的方法建立为深入验证脾主药动学奠定了基础.
在测定大鼠口服甘草甜素的血中浓度研究发现，其甘草甜素和甘草次酸的浓度变化比较大，特别是甘草甜素的浓度变化，因此我们分别进行了高浓度组和低浓度组共同测定，可得到甘草甜素高、低两组回归曲线，使这个结果可广泛用于动物、人注射GL制剂或口服中药复方前后的GL和GA药物监测.
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