【关键词】 骨形成蛋白-2
关键词: 骨形成蛋白-2;骨形成蛋白-3;突变;大肠杆菌;诱骨活性
0 引言
骨形成蛋白［1］ （bone morphogenetic proteins，BMPs）是属于TGF-β超家族的成员，目前已有18个hBMP基因被克隆.除BMP-1外，其他BMPs在胚胎时期骨组织分化发育、成年骨损伤修复、胚胎发育期中胚层的诱导和分化以及神经系统的发育和修复等方面都起着重要作用［2-4］ ，因而BMPs有十分乐观的临床应用前景.利用E.coli表达的不同的长于成熟肽的羧端肽经复性后均具有不同程度诱骨活性［5，6］ ，但对短于成熟肽的肽段及其氨基酸组成与其生物学活性的关系，尚未见报道.在上述工作的基础上，本研究在大肠杆菌中表达削短和突变的hBMP-2，3成熟肽，测试其活性，以探索其结构与功能的关系，并期望为获得更好的新型的基因工程hBMP2，3提供依据，为深入研究hBMP-2，3生物活性的分子机制和临床应用打下基础.
1 材料和方法
1.1 材料 E.coli DH5（由本教研室保存，含hBMP-2，3全长cDNA的质粒为本室扩增克隆［5，6］ ，表达质粒pDH由本实验室构建并保存，限制性内切酶、核酸修饰酶、连接酶、Taq酶等主要购于Biolabs公司.实验动物购自本校实验动物中心.
1.2 方法 计算机辅助设计hBMP-2，3成熟肽截短、突变的特异性引物，以含完整hBMP-2，3cDNA的克隆质粒为模板进行PCR，PCR引物为:BMP-2截短引物5’G TTTAAA TG AGC TGT AAG AGA CAC CC;BMP-2突变引物5’G TTTAAATG AGC TCT AAG AGA CAC CCT TTG;BMP-3截短引物5’G TTTAAATG AAT TGC GCC AGG AGA TAC;BMP-3突变引物5’G TTTAAATG AAT TCC GCA AGG AGA TAC CTC;BMP-2反向引物5’AA CTGCAG TTACTAGCGACACCCAC;BMP-3反向引物5’AA CTGCAGTTATTATCTGCAAGCGCAA在正向引物加上起始码（ATG）及DraI（TTTAAA）酶切位点，在反向引物加上强双终止码（TAATAA）和PstI（CT-GCAG）酶切位点，并将半胱氨酸（cys）突变为丝氨酸（ser）.回收PCR产物，经DraI和PstI双酶切后连接入制备好的表达载体pDH中，转化大肠杆菌DH5α.挑选阳性克隆进行序列测定和目的蛋白的诱导表达.
2 结果
首先获得了编码人骨形成蛋白-2，3成熟肽的削短和突变体的基因并将其克隆到大肠杆菌表达载体pDH上，经自动测序仪测序证实得到的基因正确无误.使其受控于PRPL启动子，构建成表达质粒pDHB2t（hBMP-2truncation）、pDHB2m（hBMP-2mutant）、pDHB3t（hBMP-3truncation）、pDHB3m（hBMP-3mutant），以大肠杆菌DH5α为宿主菌.进行温度诱导表达，经42℃5h诱导，在SDS-PAGE上各出现一条新蛋白带，分子量与预期的一致，表达量占菌体总蛋白的20%～30%，主要以包涵体形式存在.诱导后的工程菌经过化学和超声联合裂菌，所得包涵体经洗涤、离子交换层析纯化，最终纯度达到95%以上.采用稀释复性法对经过纯化的hBMP-2，3削短/突变体进行复性处理，并用铜离子催化自由巯基氧化以形成二硫键，结果获得可溶性复性蛋白.将复性产物以不同剂量植入小鼠肌袋内，12d后作组织学切片，显微镜下观察，削短的pDHB2t，pDHB3t表达产物有诱骨活性，而突变的pDHB2m，pDHB3m产物无活性. 3 讨论
hBMP cDNA编码的前体蛋白由N端的信号肽、中间的前肽和C端的成熟肽构成，必须经过翻译后加工:切去信号肽和前肽，并进行糖基化修饰，方可成为成熟的hBMP.hBMP-2和hBMP-3的成熟肽分别由114个和127个氨基酸组成.BMPs的c端保守区内的7个半胱氨酸的位置高度保守［7］ ，推测分别参与形成3对链间二硫键和一对链内二硫键.但第一个半胱氨酸是否参与了活性中心的组成，是否为其活性所必须.本研究设计分别表达hBMP-2C端102个和hBMP-3C端104个氨基酸的肽段，并把它们的第一个半胱氨酸（分别位于第2位）都突变成丝氨酸.实验结果证明，hBMP2，3成熟肽的第一个高度保守的半胱氨酸对维持其空间结构可能是必需的，突变将导致其生物学活性的丧失.图1 hBMP-2，3的结构示意图hBMP2，3成熟肽的削短和突变体基因在大肠杆中得到高效表达，获得了表达有诱骨活性的削短的pDHB2t，pDHB3t的工程菌，初步探索了纯化和复性工艺，为以后的基因工程生产奠定了基础.而我们研究组已初步探索出BMP活性的定量测定方法，有关截短的BMP-2，3的活性与其成熟肽活性的对比研究正在进行中.
参考文献
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