关于可溶性抗HAV抗体Fab片段的原核表达

作者：于长明，宋宏斌，刘国奇，杜桂鑫，徐志凯，王海涛

【关键词】 基因表达
　　关键词: 甲型肝炎病毒;Fab片段;基因表达
　　
　　甲型肝炎病毒（HAV）是危害人类健康的致病原之一，目前已有多种用于接触前预防的甲肝疫苗;但对于接触后预防或短期到HAV高流行区的旅游者的预防，则多采用免疫球蛋白作被动免疫.在接触后（14d内）和潜伏期早期，注射免疫球蛋白预防甲肝的有效率达85%左右.血源性免疫球蛋白虽然效价高，应用效果好，但可能被血源病原体污染.因此基因工程人源抗体有望成为接触后预防的首选制剂.我们从人源噬菌体抗体组合文库中筛选到一株甲肝特异性抗体［1］ ，在此基础上构建了可溶性表达载体，并获得可溶性表达，为该抗体的进一步研究打下基础.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 可溶性表达载体的构建
　　以SpeI，NheI双酶切噬菌体抗体表达载体质粒pComb3（本室保存），除去噬菌体包膜蛋白基因Ⅲ的片段，粘端自身环化，转化大肠杆菌XL1-Blue，得到可溶性Fab的表达载体psFab［2］ .
　　
　　1.2 可溶性Fab在大肠杆菌中的表达
　　将37℃过夜培养的阳性菌体按10g L-1 体积接种于含50μg L-1 羧苄青霉素SB培养基30g L-1 蛋白胨，20g L-1 酵母提取物，10g L-1 MOPS），生长至A600nm =0.2～0.4，加入IPTG至1mmol L-1 ，30℃培养过夜，10000r mim -1 离心10min，上清即含有Fab.
　　
　　1.3 免疫印迹
　　培养上清经SDS-PAGE后电转移到硝酸纤维素膜上，用HRP-羊抗人IgG Fab（Pierce）处理，DAB显色. 1.4 ELISA检测 抗人κ链单抗（1g L-1 ，Pharmingen产品）包板，加入培养上清37℃孵育1h，洗板，加入甲肝抗原，37℃孵育1h，加入HRP-抗HAV单抗37℃孵育40min，洗板，显色，测A490nm .
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 表达载体的构建
　　用SpeI，NheI切去基因Ⅲ，自连转化，挑取克隆酶切鉴定，被切除基因Ⅲ后的质粒经XbaI，XhoI双酶切可获得1.6kb的片段（图1）.
　　
　　2.2 免疫印迹实验
　　还原条件下，在分子质量为23ku左右显出两条带;非还原条件下，在分子质量为48ku左右显出一条带（图2），说明在培养上清中有二硫键形成的可溶性Fab的表达，该Fab段是由Fd及轻链两条大小不同的分子折叠而成. 　　2.3 ELISA检测
　　用抗人κ链单抗捕获表达的Fab段，检测其与甲肝抗原的结合活性，结果证明培养上清中的Fab段可与细胞培养的HAV抗原特异结合，结合活性良好（表1）.

　　3 讨论
　　噬菌体抗体借助单链噬菌体包膜蛋白Ⅲ将Fab段表达在噬菌体的表面，用内切酶将与Fd段融合的包膜蛋白基因Ⅲ片段从表达载体pComb3中除去改建成Fd段和轻链单独表达的可溶性表达载体，转化大肠杆菌，经IPTG诱导后收取上清，即检测到Fab的表达.
　　
　　从大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段是抗体工程的重要进展［3］ ，这是通过分泌型表达，Fd及轻链基因产物在信号序列的引导下，使抗体片段定位表达于质周腔，并在这一类似于真核内质网腔的氧化环境中完成折叠及二硫键的形成［2］ ，这部分抗体分子片段在培养过程中，依菌株和培养条件的不同而向培养上清中有不同程度的渗漏，具体的分子机制尚不清楚［4］ .在我们的实验条件下，可从培养上清中直接检测到有抗体结合活性Fab段的表达.
　　参考文献:
　　
　　［1］Yu CM，Du GX，Mao CS，Song HG，Xu ZK，Wang HT.Selec-tion of human phage antibodies against HAV and DNA sequence analysis ［J］.Zhonghua Ganzangbing Zazhi（Chin J Hepatol），1999;7（3）:162-164.
　　［2］Barbas CF，Lerner RA.Combinatorial immunoglobulin libraries
　　 on the surface of phage:rapid selection of antigen-specific Fabs ［J］.Comp Methods Enzymol，1991;2（2）:115-124.
　　［3］Pluckthun A.Antibodies from Escherichia coli ［J］.Nature，1990;347:497-498.
　　
　　［4］Pack P，Kujau M，Schroeckh V，Knupfer U，Wenderoth R，Riesenberg D，Pluckthun A.Improved bivalent miniantibodies，with identical avidity as whole antibodies，produced by high cell density fermentation of Escherichia coli ［J］.Biotechnol，1993;11（11）:1271-1277.