作者：廖琪桦，高辉，陈南春，杨安钢，陈苏民，粟宽源，余宙耀
【关键词】 噬菌体抗体
关键词: 噬菌体抗体;Fab段;电泳，聚丙烯胺凝胶;免疫印迹法
摘 要:目的 观察从已构建的人抗-HBsAg噬菌体抗体库中筛选出的特异性抗体的表达情况. 方法 构建可溶性Fab段表达载体，进行SDS-PAGE和免疫印迹试验检测其表达的情况，并通过ELISA实验证明Fab段抗体对HBsAg具有亲和力. 结果 所得到抗体在还原条件和非还原条件下的表达情况与预期相同. 结论 观察到的抗体的表达情况为进行大量制备纯化奠定了基础.
Keywords:phage antibody;Fab fragment;elecrophoresis，polyacnylamide GeL;immunoblotting
Abstract:AIM To observe the expression of the selected antibodies from the constructed phage display library.METHODS The expressive vectors of soluble Fab fragment were constructed and the expression of the antibodies was ob-served through SDS-PAGE and western blotting.The affini-ty of Fab fragment and HBsAg was also shown by ELISA.RESULTS Expressions of antibodies under the reductive and non-reductive conditions were detected as we thought.CONCLUSION The results of antibodies’expressions are available for the further research.
0 引言
1989年分别由英国剑桥的Winter研究组
［1］ 和美国加州的Lernerd研究组
［2］ 同时创立了噬菌体抗体库技术，这一重大技术被称为抗体第三次革命中的革命，从此用丝状噬菌体表面呈现技术制备高亲和力特异性抗体成为可能.噬菌体抗体库技术的发展为制备基因工程抗体提供了有力的工具.利用该项技术人们可以制备出各种的基因工程抗体.我们用噬菌体表面呈现技术克隆到人抗HBsAg的噬菌体抗体，对所得到的Fab段抗体进行表达.
1 材料和方法
1.1 材料
大肠杆菌菌株XL-Blue及辅助噬菌体VCSM13为我室保存.HBsAg预包被板:华美生物工程公司产品.SB培养液:30g・L-1 蛋白胨，20g・L-1 酵母提取物，10g・L-1 MOPS，pH7.0.限制性内切酶为宝灵曼公司产品.
1.2 方法
可溶性Fab段表达载体的构建用SpeI和NheI双酶切噬菌体抗体表达载体，除去噬菌体基因Ⅲ片段，自身环化后得到可溶性Fab段表达载体.将得到的表达载体转化到大肠杆菌XL1-Blue中，挑取单个菌落，在含有氨苄青霉素的SB中生长到A600 nm=0.2～0.4，加入IPTG至3mmol・L-1 ，32℃培养过夜，离心收取上清.分别取制备好的未诱导和诱导的蛋白样品在还原和非还原的条件下进行SDS-PAGE.样品经SDS-PAGE后电转移到硝酸纤维素膜上，用羊抗人IgG-Fab（Sigma）处理，NBT/BCIP（Promega）显色.用华美生物工程公司出品的抗-HBsAg的ELISA试剂盒，将菌体裂解物、阴性对照和阳性对照各50μL加入相应孔，每孔加酶标结合物50μL混匀，并且设对照孔.37℃反应20min，用清洗液洗5次后，加入显色剂37℃避光显色15min左右，观察结果.
2 结果
2.1 可溶性Fab段抗体在大肠杆菌中的表达
含可溶性抗体质粒的菌株和仅含pComb3H的菌株经IPTG诱导5h后，分别取菌体，冻融细胞的上清做120g・L-1 SDS-PAGE.结果表明:在还原条件下出现Mr 23×103 的新的蛋白条带，而在非还原条件下出现Mr 48×10 3 左右的新的蛋白条带.和预期的结果一致（Fig1～3（略））.
噬菌体抗体借助单链噬菌体外壳蛋白Ⅲ将Fab段表达在噬菌体颗粒表面，用内切酶将基因Ⅲ片段从表达载体中除去，得到可溶性Fab段表达质粒［3］ .转化大肠杆菌XL1-Blue后，经IPTG诱导后，取菌体，冻融细胞上清做Western鉴定，结果如下:在还原条件下出现Mr23×10
3 的新的蛋白条带（Fig4（略）），而在非还原条件下出现Mr48×103 左右的新的蛋白条带（Fig5（略））.和预期的结果一致.
2.3 ELISA试验 按上述步骤得到的抗体做ELISA鉴定.结果表明，所筛选到的阳性克隆与HB-sAg作用后均呈现反应（Fig6（略））.
3 讨论
抗体库技术的出现，绕过了杂交瘤途径制备单克隆抗体，开创了抗体制备的新时代［4］ .噬菌体抗体库技术与传统的杂交瘤技术相比具有明显的优越性:①简便易行，节省时间;②筛选的容量大;③抗体库技术直接得到抗体基因，避免了杂交瘤细胞克隆不稳定的缺点;④抗体库抗体可用原核细胞表达，无需组织培养，可大大降低单克隆抗体生产的成本.
采用分泌表达载体.将抗体的轻链和重链在宿主菌的外周质中进行组装，证明，将Fab片段分泌到外周质是表达和生产有功能的抗体片段的一个很好的策略.在外周质中的抗体片段之所以有功能，一个原因是外周质提供了适当的氧化环境，使蛋白折叠时能形成稳定的二硫键.除此之外，在折叠过程中Fd片段和轻链可以互为模板进行折叠.在本实验中我们分别取了菌体、冻融细胞的上清来做表达的研究.在还原的条件下，抗体Fd段和轻链之间的二硫键被打开，因此得到Mr 23×10 3 左右的条带.在非还原的条件下，由于未破坏抗体Fd段和轻链之间的二硫键，则出现了相对分子质量在48×103 左右的条带.这个结果证明了可溶性Fab段的表达.在实验的过程中我们也发现了一个现象，载体未经诱导和诱导后有时均出现有表达的情况，我们推测可能的原因是所用的载体是pComb3经改造而来的，它把抗体轻链和重链的表达置于同一个操纵子下，可能存在操纵子调控上的问题，至于确定的原因有待于进一步的探讨.在获得了可溶性Fab段抗体表达载体后，我们又进行了一次ELISA实验，结果表明我们获得的是对HBsAg的特异性的抗体.
参考文献
［1］Winter G，Griffiths AD，Hawkins RE，Hoogenboom HR.Mak-ing antibodies by phage display technology ［J］.Annu Rev Im-munol，1994;12（7）:433-455.
［2］Huse WD，Sastry L，Iverson SA，Kang AS，Alting-Mees M，Burton DR.Generation of a large combinatorial library of the immunoglobulin repertoire in phage lamda ［J］.Science，1989;246:1275-1281.
［3］Wang Y，Liu QY，Xu JJ，Chen JH.Expression and analysis of human anti-HBsAb gene ［J］.Zhonghua Weishengwu Yu Miany-ixue Zazhi（Chin J Microbiol Immund），1995;15（5）:304-307.
［4］ Huang JS，Guo QM.Genetic engineering antibody ［M］.Guangzhou:Press of South China Tech Univ，1997:142-161.