作者：石梅，魏丽春，马海昕，杨守京，陈良为
【关键词】 c-fos
关键词: c-fos;宫颈肿瘤;放射治疗
摘 要:目的 探讨放疗前、后人宫颈癌组织原癌基因c-fos表达的变化及意义. 方法 取临床确诊为宫颈鳞状细胞癌患者的活检组织标本共18例，其中放疗前8例，放疗后10例，在多聚甲醛固定的活检癌组织冰冻切片上，进行Fos蛋白的免疫组织化学染色. 结果 放疗前的宫颈癌组织内，多数癌细胞呈Fos免疫染色阳性;照射（30～40Gy）后的宫颈癌组织Fos免疫染色显著降低（P&<0.01），多数癌细胞无Fos染色，但放疗前、后间质细胞的Fos免疫反应无明显变化. 结论 放射明显抑制宫颈癌细胞的Fos表达，Fos的表达状态可作为放射治疗中评价宫颈癌细胞增殖的分子指标之一.
Keywords:c-fos;cervix neoplasms;radiotherapy
Abstract:AIM To investigate changes of c-fos oncogene ex-pression in the human cervical cancer following irradiation and elucidate its significance in radiotherapy.METHODS Eighteen cervical cancer biopsy tissues were taken from pa-tients diagnosed with squamous cervical cancer，in which ten were treated with radiotherapy;Immunohistochemical stain-ing was performed for Fos protein in formalin-fixed freezing sections.RESULTS The majority of cancer cells showed
Fos-immunoreactivity（Fos-IR）before irradiation.Following irradiation（30～40Gy）Fos-immunoreactivity decreased re-markably（P&<0.01），and Fos-immunopositive staining was hardly detected in most of cancer cells.No obvious change in Fos-immunoreactivity，however，was seen in mesenchymal connective tissue following irradiation.CONCLUSION Irra-diation inhibits Fos expression in cervical cancer cells.The present results also suggest that c-fos oncogene expression may be regarded as a molecular marker for valuing the cancer cell proliferation during radiotherapy of human cervical cancer.
0 引言
宫颈癌是人类多发性恶性肿瘤，严重危害中、老年女性的健康.放射治疗对宫颈癌具有明确有效的治疗效果.因此，探讨宫颈癌的放射生物学机制，如在细胞分子水平的变化规律，对于提高肿瘤的整体放射水平可能具有重要的借鉴意义.研究表明Fos在宫颈癌组织中有表达 ［1，2］ ，但它是否能反映放疗对癌细胞的增殖状态，目前还未见报道.因此我们利用免疫组织化学方法，探讨了放射治疗中宫颈癌组织Fos的变化及其意义.
1 材料和方法
1.1 材料
宫颈癌活检组织标本18例（n=18），取自临床病理诊断为磷状细胞癌患者，病理分级为Ⅰ～Ⅱ.年龄36～56岁.其中，放疗前标本8例，放疗后标本10例.接受放射治疗的患者分别为15～20次（30～40Gy）.宫颈癌活检组织标本，入40g L-1 多聚甲醛，0.1mol L-1 磷酸缓冲液（PB，pH7.4），4℃下固定24～48h，然后换入30g L-1 蔗糖溶液内，4℃下过夜.冰冻连续冠状切片，切片厚10μm，切片按顺序分为数套，置于-20℃保存备用.染色前将切片晾干，然后分别作常规HE染色、Fos免疫组化染色和对照染色.
1.2 方法
切片于10mmol L-1 PBS内洗10min，再入含0.3mL L-1 过氧化氢溶液内处理30min，用以灭活内源性过氧化物酶.经PBS洗后，入兔抗Fos多克隆抗体（1 5000，CALBIOCHEM，用含2mL L-1 正常山羊血清和0.1mL L-1 Triton X-100的PBS稀释，1 100）内，于4℃下孵育48h.然后入bi-otin标记的羊抗兔IgG（1 200，Vector公司）溶液内，室温下放置4h.入ABC复合物（1 200，Vector公司产品）溶液，室温下孵育2h.每次抗体孵育后均用PBS洗，3×10min.最后入DAB/h3 O 2 溶液（0.05g L-1 /0.01g L-1 ）反应10min.另外，用正常小鼠血清溶液代替特异性第一抗体孵育切片，作为免疫染色对照.
1.3 半定量分析
参照以往文献中的定量方法［4］ ，对Fos免疫染色阳性细胞进行半定量分析.在放疗前和放疗后活检组织10μm切片（10张/例）上，随机选取一高倍视野，计数单位面积（62500μm2 ）阳性细胞数目.统计学处理:比较放射治疗前与放射治疗后两组的Fos免疫阳性胞体细胞数目x ±s，进行单因素χ2检验.
2 结果
在HE常规染色的切片上，放疗前的宫颈组织可见大量的癌细胞分布，癌细胞呈卵圆形或不规则型，癌细胞增殖旺盛，可见病理性核分裂像.镜下视野多为癌细胞占据，间质较少（Fig1（略））.经15～20次（30～40Gy）的照射后，癌组织明显减少，少数残留的癌细胞呈巢状分布，其间为丰富的间质结缔组织增生，间质内可见大量的白细胞浸润（Fig2（略））.
2.1 Fos免疫反应产物的形态特征
在应用特异性第一抗体孵育的切片上，Fos的免疫反应阳性产物呈深棕色，主要定位于细胞核内，部分产物弥散分布在细胞核膜或核周.在用正常血清取代特异性第一抗体进行孵育的切片上，未见到Fos的阳性染色.
2.2 Fos免疫阳性细胞的分布
放疗前宫颈癌组织呈Fos免疫阳性染色，多数癌细胞呈中等或强的免疫着色，部分免疫染色产物弥散分布在核膜与核周胞质内（Fig3（略））.放疗后的活检组织标本上，残留的癌细胞巢内检测不到明显的Fos免疫染色，肿瘤间质内Fos免疫反应微弱，大量的间质组织内只见到少数呈弱阳性的Fos免疫染色（Fig4（略））.
随机选取放疗前和放疗后标本组织切片，在高倍镜（40×10）视野下，计数相同单位面积（62500μm2 ）内Fos免疫阳性细胞数目.可见放疗后Fos阳性癌细胞数降低，而Fos阳性的间质细胞数目无明显变化（Fig5），经统计学分析（单因素χ2 检验），表明放疗前、后Fos免疫阳性癌细胞具有明显的差别（P&<0.01），但放疗前、后Fos阳性的间质细胞数目无统计学意义的差别.
3 讨论
我们发现放射治疗（30～40Gy）可以使宫颈癌组织的Fos表达下降，Fos的表达水平从放疗前中等程度表达下降为几乎阴性.而放疗前、后间质组织细胞Fos的表达无明显变化.提示放疗可能影响宫颈癌组织细胞的增殖活动.
c-fos基因是广泛存在于细胞基因组织中的细胞初级反应基因之一，其蛋白产物p62与c-jun癌基因的蛋白产物p39构成增强子结合蛋白AP-1，通过与启动基因上的特殊DNA序列结合，调控一些基因的转录与否，与细胞的生长调节和分化密切相关［8，9］ .在正常情况下，c-fos参与细胞的生长、分化、信息传递和能量代谢过程，病理情况下，c-fos基因表达与调控的变化与多种疾病的发生发展有关［11-13］ .
Fos在不同的组织类型和癌细胞中的表达已有许多报道，其中包括宫颈癌癌前病变和癌组织中的表达［1-6］ .这些研究多认为Fos在肿瘤组织中表达越强，肿瘤细胞的增殖越快，复发和转移的比率越高，但对于放疗对宫颈癌细胞Fos表达的影响缺乏研究.Ogawa等［4］ 观察了头颈部鳞状细胞癌的患者，在放射治疗过程中Fos表达的变化与治疗效果的关系，认为Fos的表达与放射敏感性相关.我们的研究结果表明，放射治疗在直接杀死癌细胞的同时，可以抑制宫颈癌细胞的增殖，这 可能是宫颈癌放疗效果较好的原因之一，提示Fos表达的变化，可以作为评价宫颈癌放射治疗效果的分子指标.
3.2 放疗对间质细胞Fos表达的影响
我们观察到，放疗后间质中结缔组织大量增生，间质增生是组织对放射损伤修复的反应.同时放疗前后，Fos阳性的间质细胞数目无明显变化，可能解释为Fos的表达与不同的细胞类型和受照射时间、剂量有关［8-10，13］ .研究表明［7，11-12］ ，细胞的生长阻滞、分化停滞或DNA持续损伤等均是放射诱导Fos等早反应基因表达的重要条件，故间接表明，在照射15～20次（30～40Gy）时，并未对结缔组织中的间质细胞造成放射性损伤，这也可能是选择术前放疗剂量控制在40Gy以内的一个依据.c-fos在正常组织和癌组织中均可表达［6-7，9-12］ ，但表达途径不同，其意义也不相同.癌组织中Fos的表达，与肿瘤细胞的异常增殖有关［11，12］ .编码生长因子、细胞因子如TNF-α，IL-1，TGF-β等的基因，是放射诱导c-fos等早反应基因重要的效应器.组织对放疗的敏感性、放疗后组织的纤维性变等与这些因子有关.此外，c-fos等在射线直接杀死和放射诱导细胞凋亡时，对促进修复组织的增殖也具有重要作用［8，9］ .因此，深入探讨放射对癌组织c-fos及相关基因活动的影响，对进一步认识肿瘤的放射敏感性基础、放射生物学的分子基础等具有重要意义.
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