关于带有蛋白转导结构域的bcr/abl癌蛋白片段表达及其跨膜转运

作者：梁英民 ，孙强 ，蒋姗姗 ，陈萍，王冀姝，刘利，李荣，周鹏，王键，黄红艳，韩骅


【关键词】 大肠杆菌
　　关键词: 蛋白转导;bcr/abl;慢性粒细胞白血病;基因表达;大肠杆菌
　　
　　人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）-1编码的反式激活蛋白TAT具有独特的跨膜运转方式，而且有转导速度快，效率高的特点，被称为蛋白转导结构域（protein transduction domain，PTD）［1，2］ .本研究用PCR扩增了慢性粒细胞白血病慢粒bcr/abl融合蛋白的基因片段，在其5′端融合PTD结构域的编码区后在大肠杆菌中进行了表达.表达产物经纯化后，加入培养的HL60细胞，表达的蛋白可直接进入细胞内.这一结果为用外源蛋白负载（Loading）免疫细胞提供了新的途径.
　　 1 材料和方法
　　 1.1 DNA重组
　　人工合成（宝生物工程公司）编码HIV-1TAT蛋白的PTD结构域的DNA片段（序列是:有意义链:5′-TATGTATGGTAGGAAGAAACGTCGACAGCGTCGTCG GC;反意义链:5′-TCGAGCCGACGACGCTGTCGACGTTT-CTTCCTACCATACA），合成的片段磷酸化后，插入质粒pET-16b（Navagene公司）的NdeⅠ和XhoⅠ位点，得到质粒pET-16b-PTD.这样表达的蛋白N末端带有His标签，有利于后续的蛋白纯化.以带有人bcr/abl（b3a2）融合基因的质粒pGD210（本校唐都医院血液科刘利博士提供）为模板，用PCR扩增bcr/abl融合蛋白基因跨越融合点的532bp基因片段（93aa-225aa）.PCR引物的序列为:上游引物:5′-CTCGAGACGTTCCTGATCTCCTCT;下游引物:5′-GGAT-CCTTAGTAGTTGCTTGGGACCCA.PCR产物经电泳纯化后插入T载体（Promega），进行DNA序列分析.从正确的克隆中切下片段，插入质粒pET-16b-PTD，得到表达PTD-bcr/abl融合蛋白的质粒pET-16b-PTD-bcr/abl，简称pEPb.
　　
　　1.2 重组蛋白的诱导表达和纯化
　　用表达质粒转化大肠杆菌BL21（Navagene公司），挑取阳性单克隆过夜培养，加入（IPTG）至终浓度0.001mol・L-1 ，诱导表达不同时间后，收集菌体，悬浮于PBS，超声裂菌，除去杂蛋白.用8mol・L-1 尿素溶解沉淀的蛋白，在Ni-NTA-agarose柱上进行亲和层析，收集洗脱的蛋白，透析后冻干保存.
　　 1.3 PTD介导的bcr/abl蛋白的跨膜转运
　　将100mg-1 HL-60细胞孵育2h后，将细胞裂解，取上清SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至硝酸纤维素滤膜，进行Western blot分析，同时取纯化的PTD-bcr/abl作阳性对照. 　　 2 结果
　　 2.1 PTD-bcr/abl融合蛋白的表达与纯化
　　所得到的PTD-bcr/abl表达载体pEPb，DNA序列分析表明所构建的质粒与设计相同.经SDS-PAGE分析结果表明，用PTD-bcr/abl表达质粒转化大肠杆菌BL21，表达的蛋白与用pET-16b转化的BL21.及未转化质粒的BL21裂解产物相比，在23ku处有一新生蛋白带，与预期的融合蛋白分子大小相同.灰度扫描显示IPTG诱导3h后融合蛋白的表达约占细菌总蛋白的20%.表达蛋白除去杂蛋白后，在Ni-NTA-agarose柱上进行亲和层析，经SDS-PAGE分析结果表明表达的融合蛋白被纯化为单一条带.
　　
　　2.2 PTD介导的bcr/abl蛋白的跨膜转运
　　用western blot分析结果表明:HL-60细胞与PTD-bcr/abl融合蛋白孵育2h后，HL-60细胞中检测到PTD-bcr/abl融合蛋白，表明PTD-bcr/abl融合蛋白可从培养液中直接进入细胞（Fig1）.
　　3 讨论
　　一般情况下蛋白质不能自由地从细胞外进入胞质，PTD基序的确定打破了蛋白质通常只能通过细胞表面受体和信号转导途径将其所携带的生物信息传递到细胞内的规律，为蛋白质治疗开辟了新的视野［1，2］ .我们在慢粒肿瘤抗原bcr/abl融合蛋白上融合PTD基序，用基因工程的方法合成了PTD-bcr/abl融合蛋白，使之直接从细胞外进入胞质.这一结果为我们下一步的工作，用bcr/abl融合蛋白负载激活的抗原提呈细胞（如:树突状细胞dendritic cells，DC），再以此刺激患者针对白血病细胞的细胞毒性T细胞（cytotoxic T lym-phocyte，CTL）反应，对慢粒患者进行免疫治疗奠定了基础.
　　参考文献:
　　
　　［1］Vives E，Brodin P，Lebleu B.A truncated HIV-1Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cells nucleus ［J］.J Biol.Chem，1997;272（25）:16010-16017.
　　
　　［2］Schwarze SR，Ho A，Vocero-Akbani A，Dowdy SF.In vivo protein transduction:delivery of a biologically active protein in-to the mouse ［J］.Science，1999;285（5433）:1569.转贴于