关于动力性肺动脉高压犬肺动脉PCNA及α┐平滑肌肌动蛋白的表达

代写论文网： 　　　　　　 作者：崔勤，杨景学，赵建斌，朱海龙

【关键词】 高血压
　　关键词 :高血压，肺性;疾病模型，动物;血液动力学;增殖细胞核抗原;肌动蛋白类
　　
　　摘 要:目的 探讨平滑肌细胞增殖在动力性肺动脉高压形成中的作用. 方法 利用降主动脉―左下肺动脉分流建立的幼犬动力性肺动脉高压模型，取90d肺组织病理切片，应用鼠抗人增殖细胞核抗原（PCNA）抗体、α-平滑肌细胞肌动蛋白抗体（α-actin）、及Dako二抗免疫组化检测，图像分析仪对所得结果进行分析，然后计数高倍镜下平滑肌细胞总数及PC-NA细胞阳性数，计算细胞增殖指数. 结果 分流犬左下肺动脉中膜α-actin免疫组化染色呈强阳性表达，右下肺动脉弱阳性，而对照组均呈阴性;分流犬左下肺动脉PCNA阳性信号表达明显多于右肺动脉，而右肺动脉及左上肺动脉仅有少量表达;增殖指数左下肺动脉内膜为33%，中膜11%，外膜7%，右下肺动脉仅为少量. 结论 平滑肌细胞增殖参与实验犬动力性肺动脉高压形成过程并与肺动脉压力增高程度和肺血管重构改变一致.
　　
　　
　　Keywords:hypertension，pulmonary;disease models，animal;hemodynamics;proliferating cell nuclear antigen;actins
　　
　　Abstract:AIM To explore the action of pulmonary artery smooth muscle cell proliferation in formation of dynamic pul-monary hypertension.METHODS Using the pulmonary hy-pertension（PH）model of shunt from descending aorta-to-left lower pulmonary artery，the sample of the lung tissue in shunt dogs was obtained on the90th day postoperation.The examination of PCNA andα-actin was done by immunohis-tochemistry method using PCAN andα-actin antibodies.The slices of pulmonary tissue were observed under high power microscope，and the data were analyzed by image pattern analysor.The positive cells of PCNA andα-actin were recorded and the percentage was calculated.RESULTS Ex-pression ofα-actin in left lower pulmonary artery was strong positive and right pulmonary artery milder than that in left pulmonary，and control group was negative.The positive ex-pression of PCNA in left lower pulmonary arteries was more than that of right lung and upper left lobe.The index of cell proliferation was33%in intima，11%in media and7%in ad-ventitia of left lower pulmonary arteries respectively，and on-ly a few in right lung.There is no positive expression in con-trol group.CONCLUSION Smooth muscle cell proliferation might play a part in the formation of dynamic pulmonary hy-pertension in experimental dogs，and may be identical with the elevation of pulmonary pressure and remodel of pul-monary blood vessel.
　　
　　0 引言
　　
　　肺动脉高压往往伴随肺动脉结构改变，而肺动脉的病理改变又是肺动脉压力持续上升的形态学基础，其最基本的病理改变既是平滑肌细胞的增殖肥大.增殖细胞核抗原（PCNA），平滑肌肌动蛋白（α-actin）是反映细胞增殖状态的重要生物学指标.我们利用免疫组化技术观察平滑肌细胞增殖在肺动脉高压发病过程中的作用.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料　　
　　杂种幼犬，年龄2～3mo，体质量3.5～4.5kg，雌雄不拘，分两组:组1为分流组（n=12），全部行左侧开胸，降主动脉向左下肺动脉分流术，术后90d放血处死，取肺组织行病理学检测.鼠抗人PCNA（1∶100）抗体，鼠抗人α-actin（1∶100）抗体和生物素化羊抗鼠（1∶200）抗体，均为博士德公司产品，微波修复液DAB显色液，0.01mmol・L-1 PBS液为本院病理科配制.图像分析仪（Leica Q570c）为德国产品.
　　
　　1.2 方法　　
　　利用降主动脉―左下肺动脉分流建立的幼犬动力性肺动脉高压模型［1］ ，取90d肺组织病理切片，用免疫S-P两步法进行.石蜡切片脱蜡至水后0.01mol L-1 pH7.4PBS液洗涤5min×3次（下同），30mL・L-1 h3 O 2 封闭30min，置于微波处理液中微波处理10min，冷却，洗涤，加一抗4℃过夜，37℃水箱温浴60min，生物素化二抗（羊抗鼠）37℃，30min，DAB5mg+h3 O 2 5mL显色5～10min后水洗，苏木素衬染30s，盐酸酒精分化，氨水返蓝，水洗，脱水、透明、常规封片镜检.每张切片随机选取5个不同部位，计数每个高倍镜下平滑肌细胞总数及PCNA细胞阳性数计算细胞增殖指数.空白对照实验:PBS替代第一抗体，替代对照实验:小牛血清替代第一抗体.统计学处理:数据以百分数（%）表示，统计学处理用方差分析（χ2 ）处理.
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 PCNA免疫组化结果　　
　　手术后90d可见分流犬左下肺动脉内膜细胞核内出现较多棕黄色染色，中膜较少，右肺动脉及左上肺动脉仅有少量表达，空白对照组和替代对照组呈阴性表达（P&<0.01，Tab1）.表1 分流犬不同部位肺动脉细胞增殖指数（略）
　　2.2 α-actin免疫组化结果　　
　　α-actin免疫组化染色显示分流犬左下肺动脉中膜α-actin呈阳性表达，对照组阴性表达.手术后90d可见分流犬左下肺动脉平滑肌细胞胞质内出现较多棕黄色染色（P&<0.01），右肺动脉及左上肺动脉仅有少量，空白对照组替代对照组呈阴性表达.
　　
　　2.3 Ⅰ，Ⅲ型胶原纤维免疫组化结果　　
　　分流后90d，分流犬肺动脉壁内Ⅰ、Ⅲ两型胶原均有增多，左下肺动脉多于右下肺动脉，肺间质内也可见到胶原纤维的
　　出现.　　
　　3 讨论
　　
　　正常情况下肺动脉中各种纤维含量较少，平滑肌细胞处于“休眠期”［2］ ，α-actin表达阴性或弱阳性.当其受到一定刺激时，内皮细胞及激活的血小板细胞释放有关因子如内皮依赖生长因子（EDGF）、血小板依赖生长因子（PDGF）及内皮素（ET）等，促进血管平滑肌迅速增殖，而且具有成纤维细胞样功能产生胶原纤维和弹力纤维，用以适应改变的血管张力［3］ .平滑肌肌动蛋白α-actin，作为平滑肌细胞的标记物，对于了解肺动脉平滑肌细胞增生情况有重大意义.PC-NA是一种核蛋白质、DNA聚合酶辅助因子［4］ .PC-NA的含量在细胞周期的G1 期开始增加，S期达高峰，G2 ，M期降低，G0 期测不到，其量的变化与DNA合成一致，静止细胞PCNA表达极低，增殖活跃细胞PCNA表达明显增加［5］ .Speir等［6］ 认为，引起细胞增殖的多种信号途径汇聚在G1 /S期交界处并具有一个引起DNA复制的共同机制，PCNA表达为细胞进入细胞周期进行DNA复制和分裂增殖所必需，应用反义PCNA寡核苷酸能有效抑制平滑肌细胞PC-NA表达和平滑肌细胞增殖.因此，PCNA是反映细胞增殖的另一重要生物学指标.Liu等［7］ 应用流式细胞仪对缺氧小牛肺动脉平滑肌细胞进行检测发现在缺氧12h时，肺动脉平滑肌细胞G2 /M相明显增加，但在24～48h时S相缩短，24h缺氧肺动脉平滑肌细胞PCNA较正常肺动脉增强，提示缺氧首先抑制然后刺激肺动脉平滑肌细胞增生并引起肺动脉平滑肌细胞从收缩表型向合成表型转化.Mitchill等［8］ 与Botney等［9］ 在严重无法解释的肺动脉高压患儿肺组织中，应用Ⅰ型前胶原抗体进行的免疫组化检测表明在该类患儿肺小动脉中膜内膜均有大量前胶原合成，而在正常人群的肺动脉中是不存在的. 　　我们实验中的分流犬左下肺动脉管壁内膜和中膜明显增厚，PCNA阳性率增加，平滑肌细胞主要为合成表型，部分细胞呈退化迹象;胶原纤维丰富，分布较广，在血管中、内、外膜均可见到，其排列不整，α-actin在中、内膜均表达阳性，以中膜为主;PCNA表达主要在内膜为多，这与低氧所造成的肺动脉改变有着明显的不同［10-13］ ，低氧所致的PCNA表达多位于外膜，而产生这一差异的机制尚不清楚，可能与肺动脉高压形成原因不同有关.低氧性肺动脉高压其成因在于低氧引起的肺血管痉挛，长期刺激造成多种细胞因子发生变化;动力性肺动脉高压的产生的缘于来自体动脉的高压血流，造成肺血管及其血管内的血液成分受到的切应力发生改变，一方面，高压血流直接作用于一直处于低压状态的肺血管，并在其中产生湍流，导致肺血管内皮损伤;另一方面，在高切应力作用下，引起血小板的快速释放反应，血小板聚集，释放促血管收缩物质.两种原因同时起步，导致肺血管管壁增厚，管腔狭小或闭塞.管壁僵硬，血管阻力增加，导致肺动脉压力进一步升高.
　　肺动脉高压导致血管平滑肌SMC的大量增殖.是肺动脉高压患儿出现肺血管改变的主要原因之一.从实验犬不同部位肺血管PCNA表达中我们可以看出，血管内不同压力改变，对PCNA的表达产生重大影响.此结果与Jones等［14］ 应用免疫组化方法对持续性肺动脉高压患者肺组织活检结果相一致，即不同肺动脉压力改变，产生不同肺血管改建，分流犬左下肺动脉主要接受分流来的高压体动脉血，进而迅速产生肺动脉高压并出现病理性改变，PCNA表达强阳性，而右下肺动脉主要接受来自右心室的低压血流，尽管血流有所增多，但肺循环血流动力学改变不著，病理改变也不显著，PCNA呈弱阳性表达.Everett等［15］ 对年龄为42d的SD大鼠通过建立主动脉与腔静脉间分流造成肺动脉血流增多，而肺动脉压力并无明显升高动物模型也出现相同结果.
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