作者：刘雪英 赵越平 蒋永培 汤海峰
【关键词】 T淋巴细胞
关键词 :T淋巴细胞;超敏反应，迟发型;淋巴细胞转化;淋巴细胞亚群;免疫，细胞
摘 要:目的 观察墨旱莲乙酸乙酯总提物（EAEEP）对T淋巴细胞介导的细胞免疫的影响. 方法 采用正常小鼠及腹腔注射环磷酰胺造成免疫功能低下小鼠模型，观察EAEEP对外周血CD4
+ ，CD8+ T淋巴细胞亚群比例、迟发性超敏反应（DTH）、ConA刺激的淋巴细胞增殖反应的影响. 结果 EAEEP显著抑制正常小鼠的细胞免疫功能（正常组CD4+ T淋巴细胞比例为40.13%，EAEEP大剂量组降至30.87%），而对于免疫功能低下模型鼠可显著促进细胞免疫功能（使免疫抑制组CD4+ T淋巴细胞比例由34.87%升至40.80%）. 结论 墨旱莲乙酸乙酯总提物对T淋巴细胞介导的细胞免疫具有一定的免疫调节作用.
Keywords:T-lymphocytes;hypersensitivity delayed;lympho-cyte transformation;lymphocyte subsets;immuni-ty，cellular
Abstract:AIM To explore the effect of Ethyl acetate ex-tract of Eclipta prostrata on cellular immunity in mice.METHODS The experimental immunosuppressive mice models were induced by injection of cyclophosphamide.EAEEP was given to the normal and model mice by gastro-gavage for6days to observe the effect of EAEEP on the pro-portion of T lymphocyte subsets，DTH and lymphocyte pro-liferation activated by ConA.RESULTS EAEEP signifi-cantly inhibited the cellular immunity in normal mice（The propotion of CD4 + T cells was reduced from40.13%to30.87%.），but it remarkably enhanced the cellular immunity in immunosuppressive mice（The propotion of CD4+ T cells was increased from34.87%to40.80%.）.CONCLUSION EAEEP has immunomodulatory effect on T lymphocyte.
0 引言
中药墨旱莲为菊科鳢肠属植物鳢肠（Eclipta prostrata）的干燥地上部分，具有滋肝补血、凉血止血之功能［1］ .近年药理实验表明，墨旱莲水煎剂有较强免疫调节作用［2-4］ ，为进一步探讨其作用机制及寻找其有效成分，我们采用正常及免疫功能低下小鼠模型，观察墨旱莲乙酸乙酯总提物（ethyl acetate ex-tract of Eclipta prostrata，EAEEP）对T淋巴细胞介导的细胞免疫功能的影响.
1 材料和方法
1.1 材料
健康昆明种小鼠，雄性，18～22g，二级动物，本校实验动物中心提供.EAEEP由西京医院植化室汤海峰、赵越平药师提供.（1g相当于原生药120g.主要成分为皂甙类物质）研为细末，过200目筛，用时以蒸馏水配制成适宜浓度.小牛血清，杭州四季青生物工程材料研究所生产.批号:9905.ConA，Sigma产品，华美生物工程公司分装，25mg/瓶，批号:9802.MTT，Amresco产品，华美生物工程公司分装，500mg/瓶，批号:9909.伊红-Y，Sigma产品，华美生物工程公司分装，10g/瓶，批号:9712.环磷酰胺（Cy），200mg/瓶，上海华联制药有限公司，批号:990406.用前以NS稀释至3g.L-1 .小鼠T细胞mAb及荧光抗体:抗小鼠CD4，CD8mAb为大鼠抗小鼠IgG（Coulter-Immunotech，China），FITC标记的兔抗大鼠IgG（武汉博士德公司）NU-4500E CO2 孵箱，美国Nuaire公司.Olympus CH电子显微镜，Olympus Optical Co.Ld.WZ800-D3A可见紫外分光光度计，北京第二光学仪器厂产品.游标卡尺，成都量具刃具股份有限公司.流式细胞仪Epics ProfileⅡ型（Coulter Ltd）.
1.2 方法
取小鼠随机分为6组，每组10只，①NS组（20mL・kg-1 ）;②EAEEP（4mg・kg-1 ）;③EAEEP（8mg・kg-1 ）;④Cy组（60mg・kg-1 ）;⑤EAEEP（4mg・kg-1 ）+Cy组;⑥EAEEP（8mg・kg-1 ）+Cy组.以上各组，NS及EAEEP均灌胃给药（0.2mL含10g），1次・d-1 ，连续6d，Cy于第4日腹腔注射给药1次（0.2mL含10g）.
1.2.1 免疫荧光染色法测定外周血T细胞亚群
末次给予EAEEP后24h，小鼠摘眼球取血，用肝素抗凝（5.0×10 4 U・L-1 ）.分为2管，每管0.1mL，分别加入抗CD4、抗CD8mAb，充分混匀，温育45min，用细胞洗液洗2次，1000r・min -1 离心2min，弃上清.加稀释的荧光标记的第2抗体0.1mL，温育45min，洗1次，弃上清，加红细胞溶解液3mL，充分摆动2～3min，待红细胞完全溶解后，1000r・min-1 离心2min，弃上清，再用细胞洗液洗1次，离心弃上清，余约0.5mL细胞悬液，加固定液50μL以上操作在室温（12～15℃）下进行.染色标本台盼蓝染色，死细胞率&<5%.在流式细胞仪上计数淋巴细胞3000个，从抽血采样至分析在8h内完成.
1.2.2 足跖厚度增加法检测DTH
给EAEEP后3d，小鼠ip20g・L-1 SRBC0.2mL免疫，末次给药后，用游标卡尺测量左后足跖部厚度，然后于测量部位sc200g・L-1 SRBC20μL（约1×108 个SRBC），注射后24h用游标卡尺测量左后足跖厚度.
1.2.3 MTT法测定T淋巴细胞增殖
末次给EAEEP后24h，小鼠全身用750mL・L-1 乙醇消毒，无菌下取脾，放入盛有适量Hanks液的平面皿中，用不锈钢筛网轻轻将脾研碎，制成单个细胞悬液.将细胞悬液移入带盖的无菌试管中，用Hanks液洗3次，每次离心10min.将洗过3次的细胞悬液悬浮于2mL的完全培养液中，用伊红-Y染色计数活细胞，将细胞数调成2×1011 ・L-1 .每份细胞悬液分2孔加入24孔培养板中1mL・孔-1 ，其中一孔加ConA液50μL，另一孔不加ConA作为对照.培养结束前4h，每孔弃去培养液0.7mL，加入不含小牛血清的RPMI1640培养液0.7mL，同时加入MTT（5g・L-1 ）50μL・孔-1 ，温箱中继续培养4h.培养结束后每孔加入1mL异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解，570nm测吸光度.
2 结果
2.1 EAEEP对小鼠外周血T细胞亚群的影响
与NS比较，EAEEP的大、小剂量及Cy均显著降低小鼠CD4+ T细胞亚群的数目，而对于CD8
+ T细胞亚群的数目，因所用EAEEP的剂量呈现不同的作用，大剂量的EAEEP能显著提高CD8+ T细胞亚群的数 目，小剂量的EAEEP可显著降低CD8+ T细胞亚群的数目.Cy则对CD8+ T细胞亚群无明显影响.与Cy组比较，EAEEP两个剂量均能显著提高Cy所致的CD4+ T细胞亚群数目的下降（Tab1）.表1 EAEEP对小鼠外周血CD4（略）
2.2 EAEEP对小鼠DTH的影响
与NS组比较，EAEEP大剂量组明显抑制小鼠的DTH（P&<0.01），EAEEP小剂量组无明显差异.Cy组可显著抑制正常小鼠的DTH.与Cy组比较，大、小剂量组均显著增强免疫抑制小鼠的DTH（P&<0.01，Tab2）.表2 EAEEP对小鼠DTH的影响（略）
2.3 EAEEP对ConA刺激淋巴细胞增殖反应的影响
与NS组比较，EAEEP大、小剂量组及Cy组均可明显抑制ConA刺激的淋巴细胞增殖反应（P&<0.01，P&<0.05，P&<0.01）.与Cy组比较，EAEEP大、小剂量组均显著对抗Cy对ConA刺激的淋巴细胞增殖功能的抑制（Tab3）.表3 EAEEP对ConA刺激的淋巴细胞增殖的影响（略）
3 讨论
《本草经义》中记载墨旱莲入肾补阴，具有扶正固本之作用.现代药理研究表明墨旱莲水煎剂具有显著的免疫调节作用.有报道认为墨旱莲的免疫增强活性成分为其黄酮类成分-木樨草素和槲皮素，但其免疫抑制活性成分未见报道.我们的研究提示EAEEP（主要为皂甙类成分）可显著抑制正常小鼠的T细胞介导的细胞免疫应答，而对于免疫功能低下小鼠则可增强T细胞介导的细胞免疫应答.提示墨旱莲的免疫双向调节作用与其含有两种或多种作用相反的化学成分是分不开的.同时实验结果表明剂量的变化可影响EAEEP的作用，提示剂量也是墨旱莲双向免疫调节作用的原因之一.
细胞免疫反应是机体抗细胞内病原体（如病毒、某些胞内菌、直菌）感染极其重要的防御功能，也是抗肿瘤生长、排斥同种异体移植物的主要反应类型.细胞免疫反应异常时，在临床上可出现DTH、自身免疫病、肿瘤生长、某些免疫缺陷病.细胞免疫的识别和效应阶段是由于T细胞特异性识别介导的.本研究表明EAEEP对T细胞参与的免疫应答具有显著的免疫调节作用.本结果为拓展墨旱莲应用于免疫性疾病治疗提供了一定的实验依据.
参考文献
［1］Chinese Pharmacidia（First volume）［M］.Beijing:Publishing Company of Chemical Industry，2000:306
［2］Hu HJ，Hang BQ，Liu Y.Effect of Herba Eclipta Prostrata on immune system in mice［J］.Zhongguo Zhongyao Zazhi（J China Pharm Univ），1992;23（1）:55-57.
［3］Xiong XL，Li W.Two-dimensional regulation effects of some drugs for increasing body resistance and consolidating constitu-tion on IL-2of spleen cell in mice ［J］.Zhongguo Shiyan Linchuang Mianyi Zazhi（Chin J Exp Clin Immunol），1991;3（4）:37-38.
［4］Feng MG，Ou Q，Bai J，Bai SG，Li SL，Wang YM.Effect of her-ba ectipatae extracts on mouse immune function［J］.Jiamusi Yixueyuan Xuebao（J Jiamusi Med Coll），1997;20（3）:9-10.