【关键词】 人Era
关键词 :人Era;人Era C端蛋白;大肠杆菌;基因表达
摘 要:目的 在大肠杆菌中的高表达人Era和人Era C端蛋白. 方法 PCR扩增人era基因（h-era）的全长cDNA和h-era cDNA的C端区域基因.h-era cDNA克隆到（His）6融合表达载体pRSET-C中，构建融合表达质粒并转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导表达（His）6-h-Era融合蛋白;h-era cDNA的C端区域基因克隆到非融合表达载体pDH中PL 启动子下游，转化大肠杆菌TAP106，42℃热诱导表达人Era C端蛋白（h-Era-C）.SDS-PAGE电泳、凝胶薄层扫描检测蛋白的表达. 结果 表达的（His）6-h-Era融合蛋白产物占全菌总蛋白的80%;人Era C端蛋白占全菌总蛋白的40%. 结论 人Era蛋白和Era C端蛋白在大肠杆菌中获得了高表达.
Keywords:human Era;human Era C-terminal domain;Es-cherichia.coli;gene expression
Abstract:AIM To highly express human Era（h-Era）and h-Era C-terminal domain protein in E.coli.METHODS Hu-man era（h-era）cDNA and h-era cDNA C-terminal domain gene were amplified by PCR by using a plasmid containing h-era cDNA as a template，and ligated with prokaryotic expres-sion vector pRSET-C and pDH respectively.E.coli BL21（DE3）transformed with the recombinant plasmid pRSET-C-h-era was induced with IPTG to express（His）6-h-Era fusion protein.E.coli TAP106transformed with the recombinant plasmid pDH-h-era-C was induced at42℃to express h-Era C-terminal domain protein.The expression products were i-dentified by SDS-PAGE and gel thin-layer chromatography-scanning.RESULTS the expressed（His）6-h-Era fusion protein was about80%of total bacterial protein.The ex-pressed h-Era C-terminal domain protein was about40%of total bacterial protein.CONCLUSION （His）6-h-Era fusion protein and h-Era C-terminal domain protein had been suc-cessfully highly expressed in E.coli.
0 引言
era基因首先在大肠杆菌中被发现，最早由于其编码的氨基酸序列与人及酵母的RAS蛋白有部分相似之处，命名为E.coli Ras-like（era）基因［1］ .但其后仔细分析，纠正了最初发表序列中的部分错误，并注意到仅Era N端的序列与Ras相似，Era并不属于Ras家族［2］ .大肠杆菌era基因的同源基因广泛存在于原核生物中，在蠕虫、小鼠、和人以及金鱼草（An-tirrhinum）等真核生物中，也存在与细菌era高度同源的基因［3-5］ .era基因编码的Era蛋白能特异地与鸟苷酸结合，具有GTP酶活性［2，6］ .Era蛋白N端为GTP结合区，与真核Ras蛋白中GTP结合区的氨基酸序列有显著的同源性;C端与真核Ras蛋白及其它G蛋白均无同源性，为Era所特有的保守区，其中含有VIGxxGxxIK序列，该序列是与RNA结合的KH结构域的保守序列［7］ .实验证明Era蛋白可与大肠杆菌16S rRNA结合，C端的缺失的Era蛋白不能与16S rRNA结合，失去其生物功能［8］ .因此Era是一类有别于RAS的新的G蛋白.era基因与细菌细胞周期和细胞分裂有关，是细菌生存繁殖所必需的重要基因，它对细菌细胞周期的作用点在染色体分裂之后、细胞质分裂之前［3］ .在真核细胞中，era基因也具有重要的作用.金鱼草中era的同源基因erg的缺失突变可使植物胚胎的发育受阻［5］ 人era基因的全长cDNA于1998年被克隆，与原核era基因具有很高的同源性.人Era蛋白与大肠杆菌Era蛋白的氨基酸序列有30%相同，两者的相似性为53%［4］ .人era基因的功能尚不清楚.我们采用基因工程手段，在大肠杆菌中高表达了人Era和Era C端蛋白，为制备抗人Era抗体，研究人Era和Era C端蛋白的理化特性，阐明人era基因功能打下了基础.
1 材料和方法
1.1 材料
克隆有h-era全长cDNA的质粒pBS-h-era由陈苏民教授提供;（His）6融合表达载体pRSET-C购自Invitrogen公司;表达载体pDH由本实验室在pBV220的基础上构建.E.coli TAP106和E.coli BL21（DE3）由本实验室保存提供.Taq酶、Klenow酶、限制性内切酶和T4DNA连接酶，购自Gibco RBL公司.IPTG购自Sigma公司.蛋白电泳系统为Bio-Rad公司产品.DNA测序仪为PE公司ABI377型.薄层扫描仪CS-9000为岛津公司产品. 1.2 方法
1.2.1 PCR扩增h-era
全长cDNA和其C端区域基因以pBS-h-era质粒为模板，用引物1和引物3扩增h-era全长cDNA，用引物2和引物3扩增h-era cDNA C端区域基因.PCR反应条件均为:94℃45s，58℃45s，72℃60s，共30个循环. PCR引物序列:引物1:5′-AA GGAT CCATG BamHⅠ
AATAGAGATGAACAAGATGTTCTCTTG-3′;引物2:5′-AAATGAAGCTTAAGATGAGACAGG CATTCCAC-3′;引物3:5′-AA CTGCAGTTATC PstⅠACTTGAGGAGCTTC-3′
1.2.2 重组表达质粒的构建
h-era全长cDNA的PCR产物和表达载体pRSET-C用BamHⅠ和PstⅠ酶切后连接，以连接产物转化感受态BL21（DE3）菌.h-era cDNA C端区域基因PCR产物用PstⅠ酶切，表达载体pDH用EcoR I酶切后，用Klenow补平末端，再用PstⅠ酶切.将处理过的表达载体pDH和h-era cDNA C端区域基因PCR产物连接，以连接产物转化感受态TAP106菌.重组表达质粒经限制性内切酶酶切鉴定，对酶切鉴定正确的质粒用ABI377DNA测序仪进行DNA序列测定.
1.2.3 h-Era C端蛋白的诱导表达
将含有重组表达质粒pDH-h-era-C的TAP106菌接种LB培养液中（含氨苄青霉素50g・L-1 ），32℃振荡培养过夜，10mL・L-1 转接于上述LB培养基中，32℃振荡培养至A 600nm 为0.6，转入42℃振荡培养，热诱导4h后，SDS-PAGE检测全菌中h-Era C端蛋白的表达.
1.2.4 （His）6-h-Era融合蛋白的诱导表达
将含有重组表达质粒pRSET-C-h-era的BL21（DE3）菌接种于2×YT培养基中（含氨苄青霉素50g・L-1 ），32℃振荡培养过夜，10mL・L-1 转接于上述2×YT培养基中，32℃振荡培养至A 600nm 为0.6，加入IPTG至终浓度0.3mmol・L-1 ，继续诱导培养4h，SDS-PAGE检测全菌中（His）6-h-Era融合蛋白表达.
1.2.5 SDS-PAGE蛋白电泳
配制60g・L-1 的浓缩胶和120g・L-1 的分离胶，按Bio-Rab公司蛋白电泳系统的说明书进行蛋白电泳，凝胶经考马斯亮蓝染色后，脱色液（200mL・L-1 乙醇，70mL・L-1 冰乙酸）脱色观察.用CS-9000薄层扫描仪在580nm波长下对SDS-PAGE蛋白电泳凝胶上的蛋白条带进行扫描，确定菌体总蛋白中目的蛋白的比例.
2 结果
2.1 h┐era全长cDNA和其C端区域基因的克隆
PCR扩增h-era全长cDNA和其C端区域基因，扩增产物经10g・L-1 agarose电泳，与1038bp的h-era全长cDNA和525bp的h-era cDNA C端区域基因大小相符（Fig1）.回收PCR扩增产物，将h-era全长cDNA和其C端区域基因分别克隆到表达载体pRSET-C和pDH中，经酶切鉴定和DNA序列测定，将序列完全正确的重组表达质粒分别命名为pRSET-C-h-era和pDH-h-era-C. 2.2 h┐Era C端蛋白和（His）6┐h┐Era融合蛋白的诱导表达
含有pDH-h-era-C质粒的TAP106菌42℃热诱导4h;含有pRSET-C-h-era质粒的BL21（DE3）菌IPTG诱导4h，经SDS-PAGE可见，与未诱导的对照菌相比较两者分别Mr 约21000和42000处有明显的新生蛋白表达带出现，大小与h-Era-C蛋白和（His）6-h-Era融合蛋白相符（Fig2）.两者的表达产物均主要以包涵体的形式存在.
2.3 h┐Era C端蛋白和（His）6┐h┐Era融合蛋白的表达
对Fig2中SDS-PAGE凝胶上的2和4泳道的蛋白条带进行薄层扫描分析.表明，含有pDH-h-era-C质粒的TAP106菌42℃热诱导4h后，表达的h-Era C端蛋白占菌体总蛋白的40%;含pRSET-C-h-era质粒的BL21（DE3）菌IPTG诱导4h后，表达的（His）6-h-Era融合蛋白占菌体总蛋白80%（Fig3）.
3 讨论
利用大肠杆菌表达系统表达外源基因时，主要是从转录和翻译两个水平来提高外源基因的表达效率［9］ .经过多年的研究，转录水平的调控已经比较清楚，已有多种强的启动子（如T
7 ，P L ，Ptac等）可共选用.因此，高表达外源基因的关键在于翻译水平的调控.我们所用的非融合表达载体pDH中含有PL启动子，融合表达载体pRSET-C中含有T7启动子，两者均为强启动子，同时我们从三个方面在翻译水平上来实现外源基因的高表达:①调节SD-AUG间隔: 在人Era C端蛋白基因的AUG前增加两个A，使SD-AUG间隔区由GAATTAA7个核苷酸组成;②优化翻译启始区:利用密码子的兼并性来设计PCR引物，在构建重组非融合表达载体时，减少AUG下游20个碱基内的G/C含量;③利用密码子的兼并性，在设计PCR引物设计时，将一些密码子改变成为大肠杆菌的惯用密码子.此外，培养条件对外源基因的表达效率也有一定的影响.含pRSET-C-h-era质粒的BL21（DE3）菌在LB培养基中IPTG诱导（His）6-h-Era融合蛋白表达时，表达产物占菌体总蛋白的40%左右;当改用2（YT培养基时，外源基因的表达效率明显提高，表达产物达菌体总蛋白的80%.
era基因在原核生物中普遍存在，与细菌的细胞周期和细胞分裂有关，是细菌生存和繁殖所必须的重要基因.在真核生物如蠕虫、小鼠、和人以及金鱼草（Antirrhinum）中也存在与细菌era高度同源的基因.era基因编码的Era是一类新的G蛋白，该蛋白的N端为GTP结合区，C端含有能与RNA结合的KH结构域，既具有GTP酶活性，又具有与RNA结合的能力.深入研究这一从细菌到人都存在的保守的G蛋白基因的功能，将有助于进一步的认识细胞周期和细胞分裂的调控机制.
我们采用基因工程手段，在大肠杆菌中高表达了人Era和人Era C端蛋白，从而为制备抗人Era抗体，研究人Era和人Era C端蛋白的理化特性，阐明人era基因的功能打下了基础.
参考文献
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