作者：王新，黄裕新，闻勤生，王庆莉
【关键词】 肿瘤;mRNA差异显示法
关键词: 肿瘤;mRNA差异显示法;银染;基因克隆 中图号:R735.7 文献标识码:A
摘 要:目的 建立银染mRNA差异显示方法，筛选并克隆肝癌相关基因. 方法 以建系的人肝癌细胞HepG2和正常的肝细胞L02的总RNA为模板，用5’-dT11 G锚定引物和8条随机引物（AP1～AP8）组合进行RT-PCR扩增，PCR产物经60g・L-1 尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，凝胶银盐染色显示差异的DNA片段. 结果 建立了快速敏感的银染mRNA差异显示方法，分离并克隆了一些肝癌相关基因. 结论 建立的银染mRNA差异显示法简单、有效，在差异表达基因的筛选中有较高的实用价值.
Keywords:tumor;mRNA differential display;silver stain-ing;cloning of gene
Abstract:AIM To develop mRNA differential display poly-merize chain reaction（DD-PCR）method with silver staining and to clone the liver cancer related genes in HepG2cell line.METHODS Total RNA was extracted from the HepG2cells and L02cells.Their first strains of cDNA were produced by reverse transcription（RT）.The cDNA were amplified by PCR using an anchored primer5’dT11G combined with eight arbitrary primers respectively.The products of PCR were an-alyzed on a denaturing60g・L-1 polyacrylamide gel.The differential DNA bands on gel were seen by silver-staining.
RESULTS Several liver cancer related genes were isolated and identified by the sensitive silver-staining mRNA differen-tial display developed.CONCLUSION The established mR-NA differential display method with silver staining is a sim-ple，efficient means which has higher value for screening and cloning differentially expressed genes.
0 引言
mRNA差异显示（mRNA differential display PCR，DD-PCR）方法是分离差异表达基因的有效方法［1，2］ .自从DD-PCR发明以来，已被广泛用于多种差异基因的筛选和克隆，即使DD-PCR方法有一定的局限性［3，4］ ，但近年来仍有许多成功的范例［5-9］ .虽然新的差异筛选方法如代表性cDNA差异显示，消减杂交和抑制性消减杂交等应运而生并异军突起，但因DD-PCR相对简单、直观、有效而仍受众多研究者的青睐［10-13］ .常规mRNA差异显示法是通过放射性同位素进行放射自显影来比较表达基因的差异，因而给本方法的普及和操作带来了一定的困难，荧光染料法虽避免了同位素放射自显影带来的不便，但其价格较贵，且灵敏度与银染法相近.因而建立一套快速、简便、价廉、易掌握和推广的银染mRNA差异显示实用技术，在众多差异基因的初步筛选中具有很高的应用价值.我们结合自己的工作，以此方法从肝癌细胞中初步分离并鉴定了一些肝癌相关基因.
1 材料和方法
1.1 材料
人肝癌细胞系HepG2和正常肝细胞系L02购自中科院上海细胞生物研究所.菌株DH5α由本室保存.pUC-Tm载体购自上海生物工程公司.总RNA提取试剂盒，胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒为上海生工产品.反转录酶M-MulV，Taq-PlusⅠ聚合酶为MBI产品，锚定引物和随机引物由生工合成.放射性同位素购自北京亚辉公司（α-32 P-dATP和α-32 P-dCTP）.
1.2 方法
处于对数生长期的HepG2和L02细胞经酶消化后回收，清洗后，用总RNA提取试剂盒提取两种细胞的总RNA，紫外检测仪测两种样品RNA的A260 /A280 ，测RNA的含量和纯度，并用甲醛变性凝胶电泳检测样品中RNA分子的完整性;进一步用无RNA酶的DNA酶消化去除样品中可能含有的微量基因组DNA.各取5μg RNA样品，以H-T11 G为锚定引物反转录合成cDNA第1链，然后以cDNA第1链为模板，T11 G和8条随机引物（AP1～AP8）分别组合进行PCR扩增，PCR反应组成:在20μL体系中，RT产物各2μL，10×PCR buffer2μL，MgCl2 （25mmol・L-1 ）1.6μL，dNTP（400mol・L-1 ）1μL，T11 G（4μmol・L-1 ）1μL，Taq-DNA聚合酶0.15μL，去离子水11.25μL.PCR条件:95℃3min，94℃30s，40℃2min，72℃40s，40个循环，然后70℃10min终止反应.60g・L-1 尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳:配制17cm×17cm×0.15cm60g・L-1 尿素变性胶，各取8μL PCR产物，加入上样buffer，95℃变性3min，迅速冰浴，然后依次上样，TBE为电泳缓冲液，200～300V恒压电泳6～8h，至二甲苯氰指示剂抵达胶底时结束电泳.
凝胶银盐染色展示差异DNA条带参照文献［14-16］，略加修改.具体操作步骤:取下凝胶放入干净的玻璃器皿（托盘）中，去离子漂洗2～3min;100mL・L-1 醋酸中摇动固定30min;去离子水漂洗2min×3;AgNO3 （1g・L-1 ）+1.5mL，缓摇作用30min;去离子水淋洗凝胶20s;显色NaCO3 （30g・L-1 ）+1.5mL+Na2 S2 O3 ・5h3 O（2mg・L-1 ）作用2～10min;待DNA条带显现清楚，对比度清晰时，加入去离子水洗去显色液以终止反应.
直视下从凝胶中切下差异条带，按文献回收纯化DNA条带，再用与原来同样的引物和PCR条件再扩增.再扩增的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，纯化回收后与pUC-Tm载体进行连接反应，重组质粒转化大肠杆菌DH5α，然后挑取阳性克隆，提取质粒进行酶切鉴定，证实差异DNA片段已正确克隆入T载体.从阳性克隆菌中提取质粒，定量后分别在两张硝酸纤维素膜上各点质粒样品1μg（点样前，质粒样品100℃煮沸变性10min，然后迅速放入冰浴中），以已知GAPDH质粒做内参.点样后膜经碱变性处理，80℃烘烤2h，室温保存备用.同时用同样的HepG2和L02细胞中提取的RNA做反转录合成cDNA第1链，反转录过程中掺入α-32 P-dATP和α-32 P-dCTP，标记cDNA探针.然后碱水解法除去探针的mRNA.两张膜经42℃预杂交（含去离子甲酰胺）6h后，分别加入标记的两种探针，42℃杂交20h，经低、中、高严谨度洗膜后，放入暗匣中，压入X光片，-70℃放射 自显影48h.反向杂交鉴定的克隆进行DNA测序，测序结果在Gene库中进行同源性检索.
2 结果
2.1 银染mRNA差异显示
筛选出4个HepG2细胞中高表达的DNA片段，命名为HT1 ，HT2 ，HT3 ，和HT4 ，均在300～500bp范围（Fig1）.
2.2 差异表达基因克隆的酶切鉴定
2.3 反向杂交
HT2 和HT4 在HepG2中显著高表达，HT1 和HT3 无明显差异，内参GAPDH在两种细胞中的表达相似（Fig3）.HT2 和HT4 经测序及同源性检索，显示为新的基因序列.
3 讨论
自1992年Liang和Pardee建立了mRNA DD-PCR，即mRNA差异显示方法以来，此方法不断得到改进，使用的引物也不断更新.第三代引物由3个锚定引物（T11A，T11G，T11C）和8个随机引物两两组合成24个PCR反应，即可把一个细胞（约10万个基因，其中约15000个基因开放）的所有mRNA充分展示出来.我们仅使用了一个锚定引物和8个随机引物的组合.在此mRNA差异展示过程中，从提取RNA到RT-PCR，至差异展示、银染、回收在两个工作日内即可完成，大大提高了筛选的效率，不受预订同位素，自显影曝光时间的限制;银染法费用低，无污染，不需特殊设备，操作简便.从银染胶中直视下切取差异条带，无切错的顾虑.银染的灵敏性也相当高，约1～5pg・mm-2 条带，我们银染结果显示每条泳道平均可辨识80～90条DNA条带，最多者可达150余条带.
当然在银染法中需注意调整PCR反应中dNTP的浓度，浓度过高则背景深，浓度过底则显示的条带就较少，不利于筛选低丰度功能mRNA.银染凝胶电泳上样量应保证充分显示所有的mRNA，鉴于凝胶银染的灵敏度，上样量应保证足以显示所有基因而又不至于过量使条带无法分开.染色过程中注意使用去离子h3 O，所有试剂新鲜配制，戴手套操作，否则会降低银染的灵敏性.终止显色反应一般文献均用100mL・L-1 或10mL・L-1 乙酸终止，但会在凝胶中产生较多气泡，并易使条带褪色，我们的经验是用15g・L-1 EDTA溶液或去离子水置换显色液而终止反应，效果很好.
经用此法我们从HepG2中筛选出4个高表达基因，经酶鉴定证实正确装入载体，反向杂交进一步 鉴定了两个显著高表达基因，经测序及检索分析证实为新的未知基因片段（近一步的工作正在进行），这一结果说明了用此方法所得差异基因的可靠性.因而，用银染mRNA差异显示做为差异基因的初筛方法具有快速、简便、低费用和实效等特点，有较高的应用价值.
参考文献
［1］Liang P，Pardee AB.Differential display of eukaryotic messen-ger RNA by means of the polymerase chain reaction ［J］.Sci-ence，1992;257（5072）:967-971.
［2］Liang P，Pardee AB.Distribution and cloning of eukaryotic mR-NAs by means of differential display:Refinementsand optimiza-tion ［J］.Nucleic Acids Res，1993;21:3269-3275.
［3］Jurecic R，Nachtman RG，Colicos SM，Belmont JW.Identifica-tion and cloning of differentially expressed genes by long dis-tance differential display ［J］.Anal Biochem，1998;259（2）:235-244.
［4］Ledakis P，Tanimura H，Fojo T.Limitations of differential dis-play ［J］.Biochem Biophys Res Commun，1998;251（2）:653-656.
［5］Sehgal A，Boynton AL，Young RF，Vermeulen SS，Yonemura KS，Kohler EP，Aldape HC，Simrell CR，Murphy GP.Cell ad-hesion molecule Nr-CAM is over-expressed in human brain tu-mors ［J］.Int J Cancer，1998;76（4）:451-458.
［6］Arris AJ，Shaddock JG，Manjanatha MG，Lisenbey JA，Cas-ciano DA.Identification of differentially expressed genes in afla-toxin B1-treated cultured primary rat hepatocytes and Fischer344rats ［J］.Carcinogenesis，1998;19（8）:1451-1458.
［7］Schwahn DJ，Medina D.p96，a MAPK related protein，is con-sistently downregulated during mouse mammary carcinogenesis ［J］.Oncogene，1998;17（9）:1173-1178.
［8］Kim JR，Kim SY，Kim JH.Cloning of adriamycin-resistant re-lated（arr）gene in an adriamycin resistant L1210variant ［J］.Exp Mol Med，1998;30（3）:145-149.
［9］Guo CX，Tang TS，Mu XM，Li SH，Fu GQ，Liu H，Liu YX.Cloning of novel temperature-related expressed sequence tags in rat testis during spermatogenesis ［J］.Biochem Biophys Res Commun，1999;258（2）:401-406.
［10］Bangma CH，Nasu Y，Ren C，Thompson TC.Metastasis-relat-ed genes in prostate cancer ［J］.Semin Oncol，1999;26（4）:422-427.
［11］Subramaniam K，Ye Z，Buechley G，Shaner G，Solomos T，Ueng PP.Isolation of a zeta class wheat glutathione S-trans-ferase gene ［J］.Biochim Biophys Acta，1999;1447（2-3）:348-356.
［12］Scuric Z，Stain SC，Anderson WF，Hwang JJ.New member of aldose reductase family proteins overexpressed in human nepato-cellular carcinoma ［J］.Hepatology，1998;27（4）:943-950.
［13］Meng XW，Wang LH，Lin ZH，Wang XQ，Han YL，Wang MR，Lin C，Wu W.Cloning of differentiation-related genes in-duced by all-trans retinoic acid（ATRA）from human lung can-cer GLC-82cell line ［J］.Chin J Oncol，1999;21（2）:85-88.［14］Bassam BJ，Catetano-Anolles G，Gresshoff PM.Fast and sensi-tive silver staining of DNA in polyacrylamide gels ［J］.Anal Biochem，1991;196（1）:80-83.
［15］Lohmann J，Schickle H，Bosch TCG.REN display，a rapid and efficient method for nonradioative differential display and mRNA isolation ［J］.Bio Techniques，1995;18（1）:200-207.
［16］Xu GH，Ling Y，Liang DY，Cui W，Wang XM，Wan Y，Han JS.Development of silver-staining mRNA Differential Display method and cloning of morphine-induced genes in SY cell ［J］.Beijing Yike Daxue Xuebao（J Beijing Med Univ），1998;30（5）385-388.转贴于