作者：闻勤生，罗俊卿，焦成松
【关键词】 三氧化二砷
关键词: 三氧化二砷;肝癌;砷剂/治疗应用
摘 要:目的 研究三氧化二砷（As2 O3 ）对肝癌细胞的增殖抑制作用. 方法 应用台盼蓝拒染法、MTT比色法及细胞克隆形成试验，研究As2 O3 对肝癌HepG2细胞的增殖抑制和细胞毒作用. 结果 As2 O3 能显著抑制肝癌细胞的生长，5μmol・L-1 As2 O3 抑制程度明显强于1μmol・L-1 .5和1μmol・L-1 As2 O3 作用后细胞克隆形成率分别为（1.5±1.2）%和（12.3±2.2）%，明显低于对照组的（30.0±4.2）%（P&<0.01）.As2 O3 对肝癌细胞有较强的细胞毒作用，且呈明显剂量和时间依赖性，其对肝癌细胞的杀伤率高于5-氟脲嘧啶（5-FU）和丝裂霉素（MMC），但无显著性差异，As2 O3 与5-FU及MMC存在协同效应，联合应用杀伤率明显升高. 结论 As2 O3 具有明显的抑制肝癌细胞增殖作用，有必要进一步探讨其对肝癌的治疗价值.
Keywords:arsenic trioxide;liver neoplasm;arsenicals/TU
Abstract:AIM To explore the inhibitive effect of arsenic trioxide（As2 O3 ）on the proliferation of human liver cancer cell line-HepG2.METHODS The morphologic changes，proliferation ability，colony-forming rate of HepG2treated by As2 O3 were studied with light microscopy，growth curve，trypan blue and colony-forming assay.The cytotoxicity of As2 O3 on HepG2was determined by MTT assay.RESULTS Colony-forming rate of HepG2with5μmol・L-1 As2 O3（1.5±1.2）%was lower than that with1μmol・L-1 As2 O3 （12.3±2.2）%，P&<0.01and much lower than that of con-trol group（30.0±4.2）%，P&<0.01.As2 O3 had a remark-able cytotoxic effect on HepG2and cytotoxic effect was dose-and-time dependent.The cytotoxic effect was enhanced through the combination of As2 O3 with5-Fu or MMC.CONCLUSION As2 O3 can significantly inhibit proliferation of HepG2and so has a potential value of the clinical therapy on liver cancer.
0 引言
肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，转移快，死亡率高.临床上发现的肝癌，多数已失去手术机会，因此，寻找疗效好、毒副作用小的化疗药物很有必要.现已证实，三氧化二砷（As2 O3 ）治疗急性早幼粒细胞白血病（APL）疗效满意，毒副作用小［1-3］ .目前，国内外有关As2 O3 对实体瘤治疗作用的报道极少.我们观察了As2 O3 对肝癌细胞的增殖抑制作用，旨在为临床应用As
2 O3 治疗肝癌提供实验依据.
1 材料和方法
1.1 材料
As2 O3 注射液，哈尔滨医科大学附一院药剂科制备，浓度为5mmol・L-1 ，应用时用RPMI1640培养液稀释，4℃保存.肝癌细胞株HepG2由军事医学科学院分子病毒学研究所提供，RPMI1640培养液、小牛血清、台盼蓝、四甲基偶氮唑蓝（MMT）及二甲基亚砜（DMSO）均购于华美公司. 1.2 方法
1.2.1 As2 O3 对肝癌细胞生长曲线的影响
取对数生长期的肝癌细胞5×104 置于54个25mL的培养瓶中，待细胞贴壁后，实验组加入1μmol・L-1 和5μmol・L-1 的As2 O3 ，对照组加等体积的培养液，连续培养6d，每日各取3瓶，以台盼蓝拒染法计算活细胞数，取平均值，绘制生长曲线.
1.2.2 As2 O3 对肝癌细胞克隆形成的影响
取对数生长期肝癌细胞，采用有限稀释法，以每孔100个细胞接种于6孔培养板中，实验组分别加入1μmol・L-1 和5μmol・L-1 As2 O3 ，对照组加等体积的培养液，每个浓度设4个复孔，静止连续培养2wk，以台盼蓝拒染法计算细胞克隆数.克隆形成率（%）=克隆数/接种细胞数×100%.
1.2.3 As 2 O3 对肝癌细胞的细胞毒作用
采用MTT比色法.取对数生长期的肝癌细胞1×104 接种于96孔培养板中，待细胞贴壁后，实验组分别加入浓度为10，5，2和1μmol・L-1 As2 O3 ，对照孔加等体积的培养液，每个浓度设4个复孔，分别培养24，48和72h，每孔加入5g・L-1 MTT10μL，再培养4h，弃去上清液，加入DMSO100μL，振荡15min，在酶联仪570nm处测吸光度A值.杀伤率按以下公式计算.杀伤率（%）=（对照孔A值-实验孔A值）/对照孔A值×100%.
1.2.4 As2 O3 与5-FU，MMC对肝癌细胞的细胞毒作用比较
采用MTT比色法，将对数生长期肝癌细胞1×10 4 接种于96孔培养板，待细胞贴壁后，实验组分别加入As2 O3 2μmol・L-1 ，5-FU0.5g・L-1 ，MMC4mg・L-1 ，As2 O3 2μmol・L-1 +5-FU0.5g・L-1 ，As2 O3 2μmol・L-1 +MMC4mg・L-1 ，对照组加等体积培养液，按前述方法测吸光度A值，计算杀伤率.
2 结果
2.1 As2 O3 对肝癌细胞生长的影响
1μmol・L-1 和5μmol・L-1 均能明显抑制肝癌细胞的生长，随着药物浓度的增加，作用时间延长，抑制作用更明显，各浓度组和对照组之间活细胞数比较差异非常显著（P&<0.01，Fig1）.
3 对肝癌细胞克隆形成的影响 1μmol・L-1 和5μmol・L-1 As2 O3 均能明显抑制肝癌细胞的 克隆形成，克隆形成率分别为（12.3±2.2）%和（1.5±1.2）%，5μmol・L-1 组的抑制作用明显强于1μmol・L-1 组（P&<0.01），但两组与对照组（30.0±4.2）%比较差异均非常显著（P&<0.01）.
2.3 As2 O3 对肝癌细胞的细胞毒作用As2 O3 对肝癌细胞有较强的细胞毒作用，随着药物浓度的增加，作用时间的延长，杀伤率明显升高，各组间差异显著（Tab1）.
表1 As2 O3 对HepG2细胞的细胞毒作用（略）
3 与5┐FU，MMC对肝癌细胞的细胞毒作用比较 As2 O3 对肝癌细胞的杀伤率高于5-FU及MMC，但差异不显著，As2 O3 与5-FU及MMC有协同效应，联合应用后杀伤率明显提高（Tab2）.
表2 As2 O3 与5-Fu及MMC对HepG2细胞的细胞毒作用比较（略）
3 是中药复方青黛、吡霜等的主要有效成分，具有强烈的毒性，长期以来被认为是一种致癌剂，能抑制细胞DNA和RNA的合成，干扰细胞代谢，致染色体畸变，因此，用之十分谨慎.但在我国传统医学中，人们应用砷剂治疗牛皮癣、风湿病和梅毒等疾病的历史悠久.实验亦证明，适量的砷剂能刺激机体造血，对人体生理功能有益.尤其是近几年来，我国学者应用As2 O3 治疗急性早幼粒细胞白血病取得显著成效［1-3］ ，并且证实了As2 O3 是通过诱导NB4细胞凋亡而发挥治疗作用的［4，5］ .这样使As2 O3 在血液系肿瘤中的应用展示了广阔的前景.然而，As2 O3 对实体瘤是否有效，国内外报道极少［6-8］ ，未见As2 O3 治疗肝癌的报道.为此，我们于体外观察了As2 O3 对HepG2细胞生长的影响.结果表明，As2 O3 能够明显抑制HepG2细胞增殖，抑制程度与药物的浓度和作用时间有关，As2 O3 能显著抑制HepG2细胞的克隆形成，呈剂量依赖性，5μmol・L-1 组克隆形成率明显低于1μmol・L-1 组.但在临床应用中，需要考虑到随着药物浓度的增加，虽然对肿瘤的治疗作用增强，但也可能导致毒副作用增加.细胞毒实验表明，As2 O3 对HepG2细胞具有较强的细胞毒作用，杀伤率随As2 O3 浓度的上升，作用时间的延长而明显升高，呈时间和剂量依赖性;与肝癌常规化疗药物5-FU，MMC比较，其对HepG2细胞的杀伤率略高，但无显著差异，联合应用有明显的协同效应.本结果表明，As2 O3 在体外对HepG2细胞有明显杀伤作用，抑制HepG2细胞的增殖，As2 O3 能否诱导HepG2细胞凋亡我们正在进一步实验观察.因此，我们认为As2 O3 可能存在治疗肝癌的潜在价值，能否用于临床，如何掌握剂量和用法，其临床效果如何，还有待进一步进行动物实验和临床研究.
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