作者：高巍，黄裕新，陈洪，赵宁侠，王庆莉，秦明，张洪新
【关键词】 针刺
关键词: 针刺;足三里;大鼠;P物质;免疫;红细胞;T细胞亚群
摘 要:目的 研究电针（EA）刺激大鼠足三里穴对免疫活性P物质（ir-SP）及细胞免疫的影响. 方法 将大鼠随机分成正常对照组、足三里组、免疫抑制模型组、非经非穴组、足三里+免疫抑制组.应用放射免疫法测定脑垂体和外周血ir-SP含量的变化;应用流式细胞仪技术，通过微量全血直接免疫荧光染色法测定外周血T细胞亚群以反映细胞免疫功能;应用红细胞C
3b 受体-酵母菌花环试验和红细胞-IC花环试验检测红细胞免疫功能. 结果 免疫抑制模型组大鼠脑垂体和外周血中ir-SP含量、外周血的CD4+ （P&<0.01），RBC-C3b RR（P&<0.05）明显低于正常对照组，CD8+ 无显著变化（P&>0.05），足三里组+免疫抑制组各项指标与正常对照组相比无显著差异（P&>0.05）.电针刺激足三里穴后正常大鼠脑垂体和外周血中ir-SP含量、外周血的CD4+ 、RBC-C3b RR、RBC-ICR均明显升高（P&<0.01），CD8+ 无显著变化（P&>0.05），且脑垂体和外周血中ir-SP含量与CD4+ 、CD4+ 和RBC-C3b RR呈显著正相关（r=0.744，P&<0.05;r=0.738，P&<0.05;r=0.719，P&<0.05）.非经非穴组的各项指标与正常对照组相比无显著差异（P&>0.05）. 结论 电针刺激足三里穴可提高正常大鼠及免疫抑制模型大鼠的细胞免疫功能和红细胞免疫粘附功能，同时，脑垂体和外周血中ir-SP的含量也明显升高，提示针刺治疗可以提高机体免疫力，其机制可能与ir-SP合成和释放增多有关，并通过该免疫递质对神经-内分泌-免疫调节网络发挥作用.
Keywords:acupuncture;Tsusanli;rats;substance P;immu-nity;erythrocyte;T-lymphocyte subgroups
Abstract:AIM To reveal the influence of electro-acupunc-ture（EA）both on the contents of substance P in centrum and peripheral blood and on its immune function in rats.METHODS The SD rats were pided into five groups，in-cluding control group，Zusanli group，immunosuppressive model group，none point group and immunosuppressive mod-el+EA group.The contents of ir-SP in centrum and periph-eral blood were determined by Radioimmunoassay.Also T lymphocyte subgroups of peripheral blood（including CD4+ and CD8+ ）were measured by direct microvolume whole blood immunoflurescent staining technique with flow cytometry（FCM）and erythrocyte immune function（including RBC-C3b RR and RBC-ICR）were observed to evaluate the immune functions of rats from different aspects.RESULTS ①The contents of ir-SP in centrum and peripheral blood，the value of CD4+ ，RBC-C3b RR and RBC-ICR in EA group were signif-icantly higher than those of control group（P&<0.01），and the value of CD8+ was not statistically different between two groups.②The variation of CD4+ was significantly related with RBC-C3b RR（r=0.744，P&<0.05;r=0.738，P&<0.05;r=0.719，P&<0.05）.③The contents of ir-SP（P&<0.01）in centrum and peripheral blood，the value of CD4+ （P&<0.05）and RBC-C3b RR（P&<0.01）in immunosuppressive model group were observably lower than those of control group，and the value of CD8+ was not statistically different between two groups（P&>0.05），which indicated that CY restrained the T lymphocyte subgroups of peripheral blood and erythro-cyte immune function.④In immunosuppressive model+EA group，there was no marked difference as compared with con-trol group（P&>0.05），while there was statistical difference as compared with immunosuppressive model group（P&<0.01）.⑤The date of the non-Tsusanli group was not differ-ent from control group（P&>0.05）.CONCLUSION When EA improves cellular immunity induced by T lymphocyte and red blood cell immune adherence function，the contents of ir-SP in centrum and peripheral blood are improved markedly，which may have important significance in the clinical therapy with acupuncture.
0 引言
已有研究证实，针刺对红细胞免疫和T细胞亚群均有正向调节作用［1，2］ ，但其机制尚未完全阐明.我们分设多组同步、多指标观察针刺对红细胞免疫和T细胞亚群的影响，并同步检测了外周血和脑垂体中ir-SP含量的变化，旨在探讨免疫系统在针刺治疗相关疾病中的调控作用及可能的机制.
1 材料和方法
1.1 材料
上海产SD健康大白鼠（动物由本校实验动物中心提供），体质量150～180g，12～14wk.应用分段随机分组法（blocked randomization）将大鼠分为5组（每组8只）:正常对照组、非经非穴组、免疫抑制组、足三里组、足三里+免疫抑制组.G6805-A型电针治疗仪由上海医疗仪器厂生产，放免试剂盒由北京海科锐生物制品有限公司提供，Epics-profileⅡ型流式细胞仪由美国Coulter公司产.
1.2 方法
①免疫抑制模型的制作 于第1日大鼠ip新鲜配制的环磷酰胺（CY）溶液，剂量为100mg kg-1 ，第4日加强im，1次，制成免疫抑制模型.其余各组大鼠给ip同剂量的生理盐水.②针刺方法 所有实验大鼠均在安静环境下统一喂养.穴位:双侧足三里穴［3］ ，非经非穴点选足三里穴旁0.5cm处.参数选择为断续波，频率2Hz，强度3V，以大鼠后肢轻微抖动为宜.足三里组大鼠固定后每日辰时于双侧“足三里”连续刺激30min，持续7d;免疫抑制组与足三里+免疫抑制组按上述方法制成免疫抑制模型;足三里+免疫抑制组电针治疗同足三里组;正常对照组与免疫抑制组大鼠每日辰时以同样方法固定30min，但不行电针刺激.③标本采集及测定 所有大鼠于电针7d，ip，10g L-1 的戊巴比妥钠30mg kg-1 ，麻醉后断头采血，125kU mL-1 肝素抗凝.应用放射免疫分析法（radioimmunoassay，RIA）测定脑垂体和外周血中ir-SP含量，按试剂盒说明书进行.微量全血直接免疫荧光染色法检测T淋巴细胞亚群，抗大鼠CD4FITC/CD8PE单克隆抗体由英国Serotec公司 提供.应用花环法［4］ 测定大鼠的C3b 受体花环率（RBC-C3b RR）、红细胞免疫复合物花环率（RBC-ICR）.统计学处理:采用SPSS8.0软件进行数据分析，所用统计学方法为方差分析、直线相关.
2 结果
T淋巴细胞亚群和红细胞免疫功能（Tab1）、外周血及脑垂体中P物质（Tab2）均有改变.足三里组T淋巴细胞亚群和红细胞免疫粘附功能增高，同时，外周血和脑垂体中ir-SP含量也明显升高，且CD4+ 与外周血和脑垂体中P物质含量的变化、CD4+ 与C3b 受体花环率（RBC-C3b RR）呈显著正相关.免疫抑制组T淋巴细胞亚群和红细胞免疫粘附功能、外周血和脑垂体中P物质含量均下降.非经非穴组、足三里+免疫抑制模型的大鼠各项指标与正常对照组相比无显著差异.表1 T细胞亚群和红细胞免疫功能的变化（略）表2 外周血和脑垂体中P物质的变化（略）
3 讨论
3.1 电针刺激足三里穴对神经内分泌系统有调节作用
赵敏生等［5］ 观察到足三里穴的微血管立体构筑，林文注等［6］ 研究提示脊髓脑干胶状质内可能存在一条与体表足阳明胃经相对应的贯穿脊髓全长直达三叉神经脊束核等的神经网络链，这些研究结果证实了针刺足三里穴对神经内分泌调节作用的物质基础.随着针刺作用机制研究的不断深入，针刺与内分泌激素的关系越来越引人注目.研究表明，针刺对甲状腺激素、性腺激素、肾上腺皮质激素、胰岛素、脑肠肽等均有调节作用［7-9］ .P物质作为重要的脑肠肽之一，在中枢神经系统和胃肠道中均有广泛的分布，它不仅存在于内分泌和旁分泌细胞，发挥激素和局部递质作用，也存在于内源性和外源性神经元，起到神经递质的作用［10，11］ .我们证实了电针刺激足三里穴可以引起脑垂体和外周血中P物质含量的显著升高，且两者呈正相关.说明针刺足三里穴可使脑垂体中合成P物质增多，使释放到外周血中的P物质含量增加，从而发挥其特有的生理、病理生理调节功能.
3.2 电针刺激足三里穴的整体调节作用与神经内分泌免疫网络学说
研究表明，多数激素可通过分布在巨噬细胞和T，B淋巴细胞的激素受体的介导影响机体的免疫功能，同时免疫细胞也可分泌多种神经肽和激素等作为免疫递质［12］ .不仅如此，某些神经内分泌细胞也具有分泌细胞因子的功能，既可作用于神经内分泌系统又可影响免疫系统的功能.神经、内分泌、免疫三大系统主要依靠其所产生的肽类因子及其受体相互联系.因此，也可以将免疫细胞看成是体内的感受器接受抗原刺激，分泌免疫递质，将信息传到中枢神经系统后通过传出神经和激素对免疫功能进行反馈调节，这就是所谓的神经-内分泌-免疫调节网络.针刺足三里穴对神经系统、内分泌系统、免疫系统的调节作用，与神经-内分泌-免疫调节网络的内在联系是分不开的.针刺除直接调节上述各系统外，还可通过它们的内在联系间接地发挥作用.这可能正是中医整体调节的理论依据，也是传统中医学与现代医学的撞击点，即整体观的医学模式.
P物质作为经络信息传递中的重要的生物活性物质［13］ ，现代免疫学研究证实，免疫系统的细胞能释放SP并含有高亲和力的SP结合位点［14］ .SP对免疫系统的作用包括刺激淋巴细胞在体外和体内增殖，提高脾脏、肠系膜淋巴结和肠道集合淋巴结的增生性反应［15］ ，P物质在毫微摩尔水平即可诱导白介素（IL-1，IL-6）和肿瘤坏死因子（TFN）自单核细胞释放［16］ ，加强脂多糖（LPS）所诱导的人脐带血单核细胞的IL-10分泌，并逆转INF-γ对LPS诱导IL-10分泌的抑制作 用［17］ ，刺激PGE2合成，后者又反过来刺激细胞因子的生成［18］ .本研究表明，针刺足三里穴后中枢和外周血中P物质较正常对照组明显增高，且与CD4+ 的变化呈正相关，初步揭示了针刺通过刺激机体合成和释放P物质，对细胞免疫功能发挥调节作用，并通过P物质间接影响多种细胞因子的变化，从而对神经-内分泌-免疫调节网络发挥作用.而针刺足三里穴后P物质的变化与红细胞免疫的指标无相关性，说明针刺对红细胞免疫功能的影响可能不是通过P物质.
3.4 针刺足三里穴对胃肠道粘膜免疫的影响
现代免疫学研究证实胃肠肽对肠粘膜免疫细胞有重要的调节作用.肠粘膜免疫组织受肽能神经纤维支配，这些肽能神经纤维与上皮层和固有层的淋巴系统及巨噬细胞、肥大细胞等免疫细胞相毗邻，直接调节着肠道免疫系统的功能.在肠道相关性淋巴组织中，密集的SP神经末梢以及集合淋巴结中T细胞和B细胞特异性SP受体的存在提示，SP可能是肠道免疫细胞的营养因子.针刺足三里穴通过刺激机体合成和释放SP增多而达到对胃肠道免疫的调节，从而实现对胃肠道疾病及功能的调整作用，并通过GALT与全身淋巴组织的交流从另一方面达到对全身免疫系统的正向调节作用.中医学对病因病机的认识可归纳为精神因素、外邪因素和体质因素［10］ ，这也正是神经-内分泌-免疫调节网络学说所论及的内容所在.
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