作者：赵保民，黄裕新，张伟，赵宁侠，刘杰，王庆莉，王连刚
【关键词】 电针
关键词: 电针;足三里;胃泌素;受体，表皮生长因子;胃粘膜;免疫组织化学
摘 要:目的 观察电针足三里穴对胃粘膜细胞受体表达及核增殖的影响，探讨针灸作用机制. 方法 75只SD大鼠随机分段分为5组，在清醒状态下针刺实验，SABC法免疫组化染色观察胃粘膜细胞胃泌素（Gas）、表皮生长因子受体（EGFR）表达程度，AgNOR特染观察胃腺细胞增殖情况. 结果 电针足三里穴胃粘膜EGFR阳性表达率73.3%，Gas表达率66.7%;电针三阴交对EGFR表达无影响，Gas表达率为46.7%;联合穴位组Gas，EGFR表达均达60.0%，AgNOR特染各组核内嗜银颗粒无明显差异. 结论 电针足三里可提高胃粘膜细胞Gas和EGFR表达率，改变细胞分子结构，影响细胞功能.电针对胃粘膜细胞核增殖无影响.
Keywords:electroacupuncture;zusanli;gastrin;epidermal growth factor receptor;gastric mucosa;im-munocytochemistry
Abstract:AIM To observe the effect of electroacupuncture stimulation of zusanli on the expression of Gas and EGFR in gastric mucosa in order to probe mechanisms of acupuncture.METHODS 75SD rats were randomized into5groups:Control group，non-point group，zusanli group，sanyinjiao group and unite point group.All rats were experimented on consciousness.Immunohistochemical staining by means of SABC or SP technique was used to observe the expression，location and distribution of Gas and EGFR in gastric mucosa.Meanwhile，gastric mucosa cells were specially stained with AgNOR.RESUITS EGFR and Gas in gastric mucous tissue of the zusanli group after EA showed a positive expression significantly higher than those of the control and the non-acu-point group.The expressions of Gas and EGFR were en-hanced significantly（66.7%and73.3%，respectively）in zu-sanli group.The expression of Gas in gastric mucous tissue were enhanced significantly（46.7%），but the expression of EGFR kept stable in Sanyinjiao group.The expression of Gas was enhanced as significantly as that of EGFR in zu-san groups.Besides，nuclear argentaffin particles that were spe-cially stained with AgNOR didn’t change significantly.CONCLUSION Electroacupuncture stimulation of zusanli can enhance the expression rate of EGFR and Gas in gastric mucoas，but exert no effects on the proliferation of gastric mucous cells.
0 引言
中医认为，经脉与脏腑相关，针刺经络腧穴可调节脏腑功能［1］ .但针刺如何调节脏腑功能，经穴与脏腑功能联系的本质是什么?尚不清楚.前期研究发现针刺胃经腧穴引起胃运动及胃分泌功能变化［2］ ，同时，胃泌素［3］ 、胃动素［4］ 、生长抑素［5］ 、表皮生长因子［6］ 等浓度发生变化.电针足三里引起兴奋性肽类激素浓度降低如血浆及胃液Gas减少［7］ ;引起抑制性肽类激素浓度增加如胃液及胃粘膜EGF增加［6］ ，同时发现胃酸分泌降低［8］ .胃肠肽类激素与相应受体结合后发挥作用.现探讨电针足三里是否引起Gas受体及EGFR变化及胃腺细胞核增殖变化.
1 材料和方法
1.1 材料
SD种系大鼠（本校实验动物中心提供），体质量（200±50）g，12～14wk，雌雄兼配.随机分为5组（每组15只），分别为正常对照组、非经非穴组、足三里组、三阴交穴组和联合穴位组（足三里+三阴交穴）.EGFR抗体（免抗大鼠表皮生长因子受体）武汉博士德生物工程有限公司产品;Gas抗体、胃蛋白酶、即用型免疫组化染色超敏试剂盒均为福州迈新生物技术开发公司产品.DAB显色素为上海生化试剂厂产品.正常大鼠血清、PBS液（0.01mol L-1 ，pH=7.4），AgNOR工作液均由本实验室配制.
1.2 方法
大鼠在无麻醉、无创伤、完全清醒状态下接受电针刺激.穴位选取参照“中国兽医针灸学”，“大鼠的解剖和组织”而定.G6805-A型电针治疗仪（广东汕头医疗仪器厂生产）参数选择，频率范围2～15Hz，空载电压20～35V，调制脉冲为疏密波，电针时间30min，以双下肢轻微颤抖为宜.空白对照组不行针刺，其他条件与针刺相同.同一时辰电针双侧穴位.所有大鼠于电针结束前禁食24h，自由饮水，结束后即刻im846合剂10mL kg-1 ，麻醉后即刻剖腹取胃组织1.0cm×0.3cm×0.5cm，立刻置于40g L-1 多聚甲醛固定2h，然后经洗涤、脱水、透明、浸蜡和包埋后形成石蜡块.①免疫组化染色 采用链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶技术（SP法）.具体步骤如下:石蜡组织块切片（厚4μm），贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上;60℃烘烤1h后，37℃恒温箱内烘烤2d;逐级二甲苯脱蜡;递度乙醇至水;PBS洗3次，过氧化酶阻断10min;PBS洗3次，胃蛋白酶消化（37℃，20min）;PBS洗3次，非免疫性动物血清孵育（37℃，5min）;PBS洗3次，加第一抗体（抗EGFR1:50，抗Gas1:100）孵育（37℃，60min）;PBS洗3次，加生物素标记的第二抗体孵育（37℃，10min）;PBS洗3次，加链霉亲和素-过氧化物酶孵育（37℃，10min）;PBS洗3次，加DAB显色（3～10min），自来水冲洗，苏木素浅染，还蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封闭，显微镜下观察、摄影.以正常大鼠血清替代一抗作为替代对照.以PBS代替―抗作空白对照;已知阳性标本作阳性对照（生物技术公司提供）.结果判断以组织细胞中棕黄色细颗粒状染色存在为阳性.每一切片随机取5个视野，各计数20个细胞，计算阳性细胞所占比例，以-，+，，分级和统计.②Ag-NOR特染 取甲液（明胶粉2g，溶于双蒸水中至99mL，60℃使之完全溶解，然后加入纯甲酸1mL，摇匀待用.）10mL，乙液（硝酸银50g，溶于双蒸水至100 mL，充分溶解后保存于冰箱）20mL，混合于染色缸中配成AgNOR工作液.具体染色步骤:石蜡切片4μm，脱蜡至水，双蒸馏水浸洗2次，在AgNOR工作液中（25℃），染25～30min，双蒸水浸洗3次，无水乙醇浸洗2次.二甲苯 石炭酸（4 1）1min;二甲苯透明，中性树胶封固;显微镜下观察，计数银颗粒数.结果判断以高倍光镜下观察10个视野共100个壁细胞，计数每个壁细胞核内银颗粒平均数.
统计学处理:结果以阳性表达率及平均数表示，用χ2 检验比较各组显著性差异.
2 结果
2.1 电针对大鼠胃粘膜组织Gas，EGFR表达的影响
电针足三里穴组EGFR，Gas表达率均显著升高（P&<0.01）.三阴交穴组EGFR弱阳性表达，而Gas阳性表达率显著升高（Tab1）.联合穴位组EGFR，Gas表达率相同.空白对照组及非经非穴组见壁细胞，主细胞EGFR弱阳性表达.显微镜下观察见EGFR阳性表达位于胃腺颈部和体部，壁细胞、主细胞、粘液细胞和内分泌细胞质均见棕黄色染色，胃底部胃盲囊未分化粘膜（皮区）表面粘液层近细胞表面层见强阳性表达.Gas阳性表达位于胃腺体部和底部，壁细胞胞膜及胞质淡黄染色;G细胞胞质深红染色.表1 电针后胃粘膜细胞Gas，EGFR表达（略）
2.2 电针后胃粘膜组织AgNOR染色
该项研究观察了各组针刺第3次后胃粘膜细胞AgNOR的表达情况，结果显示，各组壁细胞核内银颗粒平均数分别为3.0，3.5，4.3，4.0和4.1.组间比较无显著性差异（P&<0.05）.
3 讨论
已有一些研究证实，针刺足三里使十二指肠溃疡患者G细胞数和细胞内胃泌素含量减少［9］ .耳针缘中穴大鼠颌下腺颗粒曲管细胞EGF基因表达及EGF免疫反应性增强［10］ .但尚未见关于电针足三里诱导正常大鼠胃粘膜腺细胞Gas，EGFR表达的研究报告.因此，我们系统地研究了电针足三里对人胃动素、内皮素的影响［11］ 及实验大鼠胃酸分泌功能，并同步观察了血浆、胃液及胃粘膜Gas和EGF含量变化，初步证实了电针足三里通过增加胃粘膜Gas贮存，减少Gas释放，提高胃液EGF及胃粘膜EGF浓度［6］ ，抑制胃壁细胞泌酸小管功能，达到抑制胃酸分泌.与此同时，我们也首次观察到电针对细胞胃泌素、表皮生长因子受体表达的影响.
［14］ 采用免疫组化法观察泌酸粘膜颈部粘液细胞、壁细胞膜及胞质、主细胞等有EGFR强染.壁细胞中EGF mRNA最多，主细胞次之.胃窦G细胞顶端表面有EGFR表达，提示EGFR对胃窦G细胞分泌胃泌素有调节作用.
我们发现，针刺后G细胞Gas颗粒DAB染色呈褐红色，壁细胞呈淡黄色，Gas表达强度随针刺次数增加阳性率增高.EGFR表达不仅见于壁细胞，也见于颈粘液细胞、主细胞及其他内分泌细胞.胃粘膜Gas，EGFR表达强度与同时测得胃粘膜Gas和EGF含量增高相一致.说明针刺在分子水平上调节多种细胞的活动，影响细胞内信息交流.有研究认为胃泌素基因与EGFR间存在密切联系，原代培养的EGF受体活性刺激胃泌素基因表达提高约2倍［15］ ，与本实验观察到Gas表达高于EGFR表达相一致，但EGF只是胃泌素释放的弱刺激剂.因而Gas释放量不足，血浆Gas减少，胃酸分泌减少.因此，针刺调节EGFR，既影响EGF效应又影响Gas释放.本实验 同时观察到针刺三阴交EGFR表达未见提高，但Gas 表达明显增高，与胃酸分泌结果相一致，因此，与足三里相比较，三阴交提高Gas表达，对胃酸分泌具有促进作用.
有实验认为，针刺能使大剂量肾上腺皮质激素造成的阳虚大鼠模型核酸更新率提高［16］ ，但对健康大鼠是否影响核酸更新尚未见文献报告.我们采用AgNOR特染，观察针刺3次后大鼠胃粘膜细胞增殖情况.核仁组成区（NOR）是DNA分子中指导rRNA合成的密码片段，嗜银蛋白颗粒所显示的是rRNA转录部位有关的嗜银性非组蛋白，AgNOR作为NOR及rRNA转录部位活动的标志，可以反映核仁结构的活动和功能状态.在增殖活跃的细胞中，核仁rRNA转录活性增高，银染颗粒分布于核内，使AgNOR颗粒数量绝对或相对增多，据此可以判断是否电针足三里、三阴交促进各类细胞DNA，RNA及蛋白质合成，提高细胞增殖活性.然而，本研究结果却无明显变化.可能因针刺次数少、时间短、EGF含量低而不足以影响壁细胞DNA变化.
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