关键词: 肿瘤坏死因子-α;白细胞介素-6;卵泡液;雌激素;卵母细胞
摘 要:目的 测定卵泡液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）水平，并探讨其与雌二醇（E2 ）产生及卵母细胞成熟度的关系. 方法 酶联免疫法测定97份卵胞液及26份血清标本的TNF-α和IL-6水平，放射免疫法测定E2 水平，并记录每份卵泡液中卵母细胞的成熟度. 结果 卵泡液中TNF-α和IL-6水平分别为（26.5±7.2）ng L-1 和（328.0±48.7）ng L-1 ，分别较血清中TNF-α和IL-6的水平高9倍和20倍（P&<0.01）;卵泡液TNF-α和IL-6水平与卵泡液中E2 水平及卵母细胞成熟度呈正相关（r值为0.648和0.692，P&<0.01）. 结论 卵泡液中存在较高水平的TNF-α和IL-6，其与E2 产生及卵母细胞成熟度有一定关系.
Keywords:tumor necrosis factor-α;interleukin-6;follicular fluid;estrogen;oocyte
Abstract:AIM To detect the concentrations of tumor necrosis factor-α（TNF-α）and interleukin-6（IL-6）in human follicular fluid and to evaluate their relationships to estradiol production and oocyte maturity.METHODS TNF-αand IL-6concentrations in97samples of follicular fluid and26serum samples from26patients undergoing IVF-ET were measured with enzyme-linked immunosorbent assay，and estradiol lev-els were determined by radioimmunoassay.When follicular
fluid samplas were obtained，oocyte maturity was identified.RESULTS TNF-αconcentration in follicular fluid was（26.5±7.2）ng L-1 ，and IL-6concentration was（328.0±48.7）ng L-1 .They were9times and20times higher than those in serum，respectively（P&<0.01）.In follicular fluid，the con-centrations of TNF-αand IL-6were directly proportional to estradiol level and oocyte maturity（P&<0.01）.CONCLU┐SION Higher concentrations of TNF-αand IL-6exist in fol-licular fluid and they may have a physiological role in promot-ing estradiol production and oocyte maturity.
0 引言
近年来的研究［1，2］ 发现，免疫系统对女性生殖内分泌有某些调节作用，但确切机制尚未阐明.肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）是两个重要的免疫因子，主要由巨噬细胞产生，而卵泡液中存在大量的巨噬细胞［3］ .因而我们测定了卵泡液中TNF-α和IL-6水平，以探讨其在卵巢功能局部调节中的作用.
1 对象和方法
1.1 对象 人卵泡液来自行输卵管配子移植或体外受精胚胎移植的患者，共计26（输卵管阻塞9，排卵障碍6，子宫内膜异位症5，免疫因素4，男方因素2）例，年龄平均29.4（26～36）岁，近期未患感染性疾病，血常规检查正常.促排卵及抽吸卵泡液的方法同我们以前的报道［4-6］ .26例患者共抽得107份卵泡液，平均每人抽得4.1份（2～8份）.其中10份标本有明显的血液污染（红细胞数大于4×106 L-1［7］ ），弃之未用.余97份卵泡液于2000r min-1 ，离心10min，收集上清液，-40℃低温冰箱储存备用.抽卵泡液前抽取患者静脉血10mL，室温下凝固，留取血清，-40℃低温冰箱储存备用.
1.2 方法
1.2.1 TNF-α和IL-6水平测定 采用双抗体夹心法测定卵泡液及血清中TNF-α和IL-6水平，酶联免疫试剂盒由本校免疫学教研室提供.将抗TNF-α和IL-6mAb T5和E6等量混合，以每孔4000ng包板，于4℃过夜.洗涤、封闭，加待测样本和标准TNF-α及IL-6，孵育.洗涤后加兔抗TNF-α抗体和兔抗IL-6抗体，最后加底物邻苯二胺显色，以h3 SO4 终止反应，自动酶标阅读仪（美国Bio-Red公司）测定吸光值，根据标准曲线求得待测样本TNF-α和IL-6含量.每份卵泡液及血清标本均重复实验2次，取其平均值.
1.2.2 E2 测定 采用放射免疫法同批测量卵泡液及血清标本中E2 水平，E2 放免检测药盒为上海生物制品研究所产品.
1.2.3 卵母细胞成熟度判定 参照Moussie等［8］ 标准判断卵母细胞成熟度.成熟或近成熟卵子:卵丘细胞充分伸展，放射冠细胞分散，透明带清晰可见，核及核仁消失，有时可见第一极体.未成熟卵子:卵丘细胞略伸展或紧裹着卵母细胞，透明带不清晰或看不见，可见细胞核及核仁.
统计学处理:实验数据以t检验及r检验.
2 结果
2.1 卵泡液及血清中TNF┐α和IL┐6水平 97份卵泡液标本TNF-α水平在3～80ng L-1 之间，平均（26.5±7.2）ng L-1 .IL-6水平在46～1210ng L-1 之间，平均（328.0±48.7）ng L-1 .26份血清标本TNF-α和IL-6平均水平分别为（2.9±0.6）ng L-1 和（16.7±2.1）ng L-1 .卵泡液TNF-α和IL-6平均水平分别较血清TNF-α和IL-6水平高9倍及20倍（P&<0.01）.输卵管阻塞、排卵障碍、子宫内膜异位症、免疫因素及男方因素导致不孕的各组间卵泡液TNF-α和IL-6水平均无显著性差异（P&>0.05）.
2.2 卵泡液及血清E2 水平及其与TNF┐α和IL┐6的关系 卵泡液及血清E2 平均水平分别为（14.1±2.3）μmol L-1 （2～20μmol L-1 ）和（3.0±0.2）μmol L-1 （0.6～7.0μmol L-1 ），两者比较，差异非常显著（P&<0.01）.将97份卵泡液TNF-α和IL-6水平分别与卵泡液E2 水平进行相关性检验，结果均呈正相关（r值分别为0.648和0.692，P值均&<0.01）.
2.3 卵泡液TNF┐α和IL┐6水平与卵母细胞成熟度 共采集卵子128个，其中成熟及近成熟卵子101个，未成熟卵子27个.前者卵泡液TNF-α和IL-6平均水平分别为（27.0±6.5）ng L-1 和（336.0±47.5）ng L-1 ，后者卵泡液TNF-α和IL-6平均水平分别为（25.9±8.1）ng L-1 和（319.0±67.8）ng L-1 .两者比较，TNF-α和IL-6均相差非常显著（P&<0.01）.
3 讨论
TNF-α及IL-6是两个重要的免疫因子，主要由 免疫活性细胞产生，存在于多种组织及体液中，具有多种生物学功能.卵泡液中是否存在TNF-α和IL-6及其水平，研究报道不多，结论不一.Mola等［9］ 认为卵泡液中存在IL-6，水平略高于血清水平.但也有的研究者认为，卵泡本身不能产生TNF-α和IL-6，卵泡液中TNF-α和IL-6是由血浆渗入的，其水平与血清水平一致.卵泡液中存在大量的巨噬细胞，而巨噬细胞是产生TNF-α和IL-6的主要功能细胞［3］ .分子生物学研究也证实，卵巢细胞可表达TNF-α和IL-6mRNA［10，11］ .本实验结果显示，卵泡液中TNF-α和IL-6水平分别为26.5ng L-1 和328ng L-1 ，较血清TNF-α和IL-6水平分别高9倍和20倍，而且不同病因导致的不孕症组之间无显著差异.Pellicer等［12］ 也观察到卵泡液中的IL-6水平较血清高4～20倍.所以我们认为，卵泡液中存在较高水平的TNF-α和IL-6，他们是由卵巢自身产生的、与不孕症病因无关的生理因子. 卵泡液的微环境对卵母细胞的发育极为重要，有关卵泡液中TNF-α和IL-6的生理作用及与E2 产生和卵泡发育的关系尚不清楚.Büscher等［13］ 虽然检测到卵泡液中存在较高水平的IL-6，但未发现其与E2 有相关性.我们的实验结果，卵泡液中TNF-α和IL-6水平与E2 水平呈正相关，而且TNF-α和IL-6水平高者卵母细胞成熟度佳.Mendoza等［14］ 也观察到，卵泡液中TNF-α水平高者，卵母细胞成熟度佳，受精率高.上述表明，卵巢自身产生的TNF-α和IL-6通过旁分泌或（和）自分泌方式直接或间接参与卵巢功能的局部调节，但确切机制尚待研究.
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