作者：石继红 张英起 赵宁 颜真 韩苇 赵永同
【关键词】 胸腺素α1
关键词: 胸腺素α1 ;融合表达;蛋白质纯化;生物活性
摘 要:目的 利用融合表达载体pThioHisA的重组质粒pThioHisA-Tα1 ④，转化大肠杆菌TOP10得到的工程菌，来分离纯化表达的胸腺素α1 （thymosin alpha1，Tα1 ）. 方法 将高效表达融合蛋白的工程菌用细胞破碎器裂解，经80℃热处理，离心上清采用Q-Sepharose FF阴离子交换色谱纯化融合蛋白.融合蛋白经CNBr裂解后用常压离子交换色谱纯化Tα1 单体.应用SDS-PAGE，2L-Tricine-SDS-PAGE和HPLC进行鉴定. 结果 SDS-PAGE分析表明菌体表达的融合蛋白占菌体总蛋白的400g kg-1 .经2L-Tricine-SDS-PAGE分析证实，融合蛋白可裂解出Tα1 单体，裂解物经简单的离子色谱可以纯化出Tα1 单体，HPLC鉴定纯化出的Tα1 纯度可达950g kg-1 以上.利用3 H-TdR进行的生物活性测定表明，在致有丝分裂原ConA存在的条件下，融合蛋白和Tα1 单体均具有刺激小鼠脾淋巴细胞分裂增殖的能力，与化学合成的Tα1 相比具有相似的生物活性. 结论 该方法是分离纯化Tα1 简便易行，经济有效的方法;同时也为Tα1 的分离纯化和大规模的开发生产奠定了基础.
Keywords:thymosin alpha1;fusion expression;protein pu-rification;biological activity
Abstract:AIM To purify and prepare thymosin alpha1（Tα1 ）.METHODS The engineering bacteria TOP10includ-ing recombinant plasmid of a fusion expression vector pThio-HisA with the tandem Tα1 gene of4repeats（Tα1 ④）was used.after bacteria lysated by Bionee Cell Disruoter，the lysate was incubated in the temperature of80℃for10min-utes，and cooled quickly.By Q-Sepharose Fast Flow chro-matography，the fusion protein was purified from the super-natant of the lysate.At the concentrion of0.5mol L-1 CNBr cleavage of the fusion protein in700mL L-1 formic acid，Tα1 was purified by ion exchange methods of SP-Sepharose Fast Flow and Q-Sepharose Fast Flow.These were identified by SDS-PAGE，2L-Tricine-SDS-PAGE and HPLC.RESULTS SDS-PAGE analysis showed an induced expression fusion protein band which consititued400g kg-1 of the total bacte-rial proteins.After CNBr cleavage of the fusion protein，Tα1 was obtained by ion exchange methods and proved by2L-Tricine-SDS-PAGE analysis.HPLC showed the purity of Tα1 was950g kg-1 .Their biological activity was analysed by3 H-TdR incorparation.They results showed that the fusion protein and Tα1 had the similar biological activity to that of the synthesized Tα1 .They could increase the proliferative re-sponse of the mitogen ConA stimulated spleen lymphocytes.CONCLUSION Method is convenient and simple for purifi-cation and preparation of Tα1 in large scale.
0 引言
胸腺素α1 （thymosin alpha1，Tα1 ）是从胸腺素组分5（TF5）中分离纯化出的由28个氨基酸残基组成的酸性多肽，其Mr 为3108，pI4.2［1，2］ .在各种抗原或致有丝分裂原激活后，Tα1 能够增加T细胞IFN［3］ ，IL-2［4］ 和IL-3［5］ 等淋巴因子的分泌，增加T细胞表面淋巴因子受体的水平;Tα1 还能影响NK前体细胞的募集，使其在暴露于淋巴因子后变得更有细胞毒性［6，7］ ;在活体内Tα1 能增加ConA激活后的小鼠淋巴细胞增加分泌IL-2并增加IL-2受体的表达作用［4，7］ ;配伍其他细胞因子具有抗肿瘤作用［8］ .Tα1 临床用途广泛，已应用于治疗乙肝［9］ 、丙肝［10］ 、癌症［8，11］ 及免疫缺陷［12］ 等疾病的研究中，是一种针对T淋巴细胞的免疫增强剂.
目前国外化学合成的Tα1 已临床应用，但价格昂贵.我们利用硫氧还蛋白-Tα1 ④融合基因在E.coli中的表达，经简单的预处理和离子交换色谱，得到了纯度较高的融合蛋白，把融合蛋白进行裂解获得了高纯度的Tα
1 单体，且具有较高的生物活性.该研究旨在寻找简便易行、经济有效地纯化和生产Tα1 的技术方案，为今后的大批量生产奠定切实可行的工艺流程基础.
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌体的获得 重组质粒pThioHisA-Tα1 ④由本中心构建，由重组质粒pThioHisA-Tα1 ④转化E.coli TOP10［基因型为FˉmcrAΔ（mrr-hsdRMS-mcrBC）Φ80lacZΔM15ΔlacX74deoRrecAlaraD139Δ（ara-leu）7697galU galKrpsLendAlnupG］.挑单克隆接种于5mL LB培养液，37℃振荡培养至A600nm 为0.6，按50mL L-1 接种于新鲜LB培养液中，37℃振荡培养到A600nm 为0.5，加IPTG至终浓度为1mmol L-1 ，37℃继续培养4h，离心收集菌体.
1.1.2 生化试剂 SP-Sepharose FF，DEAE-Seph-arose FF和Q-Sepharose FF购自Pharmacia公司;Tryptone和Yeast Extract为Unipath公司产品，DNase I购自华美公司，Tricine和IPTG购自Solon公司，ConA和2-巯基乙醇购于Sigma公司，DTT为Serva公司产品，CNBr购于Fruka公司，1640培养基为Gibco公司产品，其余均为国产分析纯试剂.
1.1.3 实验动物 BALB/c纯种小鼠，由本校实验动物中心提供.
1.2 方法
1.2.1 裂菌 收集菌体4g，用20mL20mmol L-1 pH8.0的Tris-HCl缓冲液混合，用细胞破碎器裂解菌体，加少许DNase I，混合均匀，37℃20min，加pH8.0的EDTA使其终浓度为2.5mmol L-1 .将裂解物80℃温育10min，迅速冰浴，离心收集上清，120g L-1 SDS-PAGE分析样品.
1.2.2 透析 上清液用1000mL10mmol L-1 pH5.5的PB透析24h，中间换1次透析液，同样条件下离心收集上清液.
1.2.3 融合蛋白的纯化 Q-Sepharose FF阴离子柱用上缓冲液平衡，上样后用0～0.5mol L-1 NaCl的PB缓冲液线性梯度洗脱，收集主峰.用h3 O透析除盐，Lowry’s法测定蛋白浓度，冷冻干燥后得融合蛋白，经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定.
1.2.4 融合蛋白的裂解 按蛋白质 CNBr为1 3的 比率加入至700mL L-1 的甲酸溶液中混匀，避光室温裂解24h，加10倍体积的纯水灭活CNBr［13］ ，充分橱内排风30min，同上进行冷冻干燥.
1.2.5 Tα1 单体的纯化 SP-Sepharose FF阳离子柱用10mmol L-1 pH5.0的NaAc-HAc缓冲液（10mmol L-1 乙酸钠，1mmol L-1 2-巯基乙醇和0.1mmol L-1 DTT）平衡.冻干样品加50mL缓冲液溶解4℃搅拌过夜，离心上清过SP-Sepharose FF阳离子柱，收集穿过峰液，冷冻干燥后用50mL含相同浓度2-硫基乙醇和DTT的50mmol L-1 （pH8.0）Tris-HCl溶解后上Q-Sepharose FF阴离子柱，用0～0.5mol L-1 NaCl线性梯度洗脱，收集主峰，测定蛋白浓度.
1.2.6 SDS-PAGE 鉴定融合蛋白采用Laemmli不连续胶［14］ ;鉴定Tα1 单体则采用2L-Tricine-SDS-PAGE
［15］ .
1.2.7 生物活性测定 用3 H-TdR掺入法，取小鼠脾脏在钢筛上研磨后用淋巴细胞分离液分离出单核细胞，用PBS洗后，悬于含10mL L-1 FCS的1640培养液中，向96孔培养板中加入4×105 /孔的脾细胞和12.5μg/孔的ConA.CO2 孵箱中37℃培养6h，再加入不同浓度的融合蛋白和Tα1 ，继续培养72h，每孔加入3 H-TdR18.5×10
3 GBq继续培养6h，收获细胞于玻璃纤维滤纸上，晾干后测定cpm值，按下公式计算增殖率:增殖率（%）=实验组cpm值-对照组cpm值对照组cpm值×100%.
2 结果
2.1 融合蛋白的纯化 SDS-PAGE分析表明，诱导表达的融合蛋白占菌体总蛋白的400g kg-1 （Fig1）.菌体裂解液经80℃热处理蛋白变性后，融合蛋白存在于离心上清中，沉淀变性的蛋白中含量极少.经SDS-PAGE分析表明，融合蛋白占上清蛋白的800g kg-1 左右（Fig1）.离心上清经Q-Sepharose FF柱层析，融合蛋白在0.24mol L-1 NaCl时被洗脱（Fig2），收集洗脱峰进行SDS-PAGE不连续电泳，考马斯亮蓝R-250染色呈一条带，纯度大于950g kg-1 （Fig1）.Lowry’s法测定洗脱主峰蛋白浓度为1.937g L-1 .融合蛋白的回收率为15g kg-1 .
2.2 Western blot分析 表达产物经SDS-PAGE后，转移到NC膜上，以鼠抗PH-Thioredoxin为Ⅰ抗，兔抗鼠IgG-AP为Ⅱ抗，碱性磷酸酶显色.可见在NC膜相应位置上呈现一显色带，未诱导菌株，标准蛋白及表达菌其他条带无阳性反应（Fig3）.
图1 － 图3 略
2.3 Tα1 的离子层析 裂解后的融合蛋白经SP-Sepharose FF阳离子柱层析，Tα1 单体仅存在于穿过峰液中，再经Q-Sepharose FF阴离子柱层析，在0.13mol L-1 NaCl时被洗脱（Fig4）.收集洗脱峰冷冻干燥，经Sephadex G-25除盐进行Tricine-SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝R-250染色呈单一条带（Fig5）.Lowry’s法测定蛋白浓度，得Tα1 约为98mg.经HPLC进行鉴定，其纯度大于950g kg-1 .
2.4 融合蛋白和Tα1 生物活性测定 加入不同浓度的融合蛋白和Tα1 纯化产物，在实验范围之内融合蛋白和Tα1 与对照组相比均具有显著性差异（P&<0.01）;而与化学合成的Tα1 相比则无差异（Tab1）.
3 讨论
Tα1 作为一种免疫增强剂，临床用途广泛［8-12］ .目前市场出售的Tα1 均为全人工合成，成本高、污染环境.而组织提取又受到材料来源的限制，且产量极低.我们开创性地采用串联体的方式使Tα1 在E.coli中得以大量表达，分离纯化简单，比国外化学合成的Tα1 成本大为降低;同时又具有操作工艺程序化、易于放大、取材不受限制和活性高等优点，为今后的大批量生产打下了坚实的基础.
表1 融合蛋白和Tα1 的生物活性 略
用pThioHisA进行的融合表达中，融合蛋白获得了高效表达，约占菌体总蛋白的400g kg-1 （Fig2），而且是以可溶性形式表达，裂菌产物热变性离心后，融合蛋白占上清蛋白的800g kg-1 ，为以后的纯化带来了极大的方便，仅需经过Q阴离子柱即可纯化出融合蛋白，纯度达950g kg-1 以上.因此，以硫氧还蛋白为融合伴侣的基因融合表达系统特别适合于E.coli中表达高产量的可溶性融合蛋白［16］ ，加之硫氧还蛋白固有的热稳定性，为其融合蛋白的分离纯化带来了极大的方便.
融合蛋白经CNBr裂解后纯化出的Tα1 与天然Tα1 存在一定的差别，即在Nh3 -端缺少乙酰基，而COOH-端则多了一个同型丝氨酸内酯，因而纯化出的Tα1 是天然Tα1 的一种衍生物.纯化的融合蛋白和Tα1 经生物活性测定，与国外化学合成的Tα1 有相当的效应，具有良好的免疫刺激活性.ConA与淋巴细胞保温6h刺激，再加入待测的样品产生的促增殖效应最佳;而将它们和丝裂原同时加入或先加入待测样品再加ConA刺激脾细胞时可产生抑制效果，有关Tα1 免疫调节机制及临床应用的探讨尚需研究.
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